第五章DNA序列测定 述 DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内容。对D一级结构的研究，有助 于探索基因结构与功能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的飞跃。测定基因 组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部遗传信总，正是人类基因组计划(human genome project,.HGP)的最主要目标之 DA测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法(Sanger法、酶促法)和化学裂解注 (Maxam-Gelbert法)。二者均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。不管是 酶促法还是化学法，都是分为4个反应体系进行测序反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置 的A、T、G或C碱基。4种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放 射自显影后，读出待测DNA的连续序列。 第一节Sanger双脱氧链终止法 一、原理（单链） DNA链中的核苷酸是以3,5-磷酸二酯键相连接，合成DNA所用的底物是2-脱氧核 苷三磷酸(dNP),在Sanger双脱氧链终止法中被掺入了2 一双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时，由于它没有3-OH,不能再与其它的脱氧核苷酸 形成3,5-磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP,则新 生链的末端就是A,依次类推可以通过惨入ddTTP、ddCP、ddGP,则新生练的末端为T、 C或G,根据这个原理，Sang©r与197年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得 了诺贝尔 在测序反应中通常设置4个反应，各反应管中同时加入一种DNA模板和引物、DNA聚合 酶I(失去5'→'外切核酸酶活性入其中一管中分别加入一种ddNTP(如ddTTP、dTTP) 以及其它三种dNTP(dATP、dCTP、dGTP),引物末端用放射性核素标记，ddTTP的比例 很小(1：10)，因此掺入的位点是随机的，经过适当的条件下温有，将会有不同长度的D阳 片段合成(P163及图) 二、DNA序列测定的策略 (一)测序载体和引物 (二)大片段DNA序列测定的策略 1.鸟枪法将长链DNA片段随机断裂成适于序列测定的片段(300-60Obp),断裂方法 有超声波处理、核酸 酶I法和限制酶切制法。2.嵌套缺失法(e,Erase-a-base (1)首先将大片段克隆到测序载体： (2)选用两种限制酶从待测DNA片段与载体序列之间将DNA切断，使切割后近载体端 为3突出的粘性末端，近待测DNA的末端为5突出的粘性末端或平端： (3)用外切核酸酶Ⅲ消化上述线性DA(3C,250核苷酸/min),在不同时间终止 反应，可以获得在同 并依次 0-250bp的DNM片段 (4)用核酸酶S1消化末端的单链，使之成平端，经T4DNA连接酶连接环化，得到 一套缺失长度不同的DNA片段克隆： (5)将各个克隆从其缺失端开始用通用引物测序。由于引物相同，测序结果可以从子
第五章 DNA 序列测定 概 述 DNA 的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内容。对 DNA 一级结构的研究，有助 于探索基因结构与功能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的飞跃。测定基因 组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部遗传信息，正是人类基因组计划（human genome project, HGP）的最主要目标之一。 DNA 测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法（Sanger 法、酶促法）和化学裂解法 （Maxam-Gelbert 法）。二者均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。不管是 酶促法还是化学法，都是分为 4 个反应体系进行测序反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置 的 A、T、G 或 C 碱基。4 种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放 射自显影后，读出待测 DNA 的连续序列。 第一节 Sanger 双脱氧链终止法 一、原理(单链) DNA 链中的核苷酸是以 3`，5`-磷酸二酯键相连接，合成 DNA 所用的底物是 2`-脱氧核 苷三磷酸（dNTP），在 Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了 2`，3`-双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP），当 ddNTP 位于链延伸末端时，由于它没有 3`-OH，不能再与其它的脱氧核苷酸 形成 3`，5`-磷酸二酯键，DNA 合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个 ddATP，则新 生链的末端就是 A，依次类推可以通过掺入 ddTTP、ddCTP、ddGTP，则新生链的末端为 T、 C 或 G，根据这个原理，Sanger 与 1977 年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得 了诺贝尔奖。 在测序反应中通常设置 4 个反应，各反应管中同时加入一种 DNA 模板和引物、DNA 聚合 酶 I（失去 5′→′外切核酸酶活性）、其中一管中分别加入一种 ddNTP（如 ddTTP、dTTP） 以及其它三种 dNTP（dATP、dCTP、dGTP），引物末端用放射性核素标记， ddTTP 的比例 很小（1:10），因此掺入的位点是随机的，经过适当的条件下温育,将会有不同长度的 DNA 片段合成 (P163 及图) 二、DNA 序列测定的策略 （一）测序载体和引物 （二）大片段 DNA 序列测定的策略 1.鸟枪法 将长链 DNA 片段随机断裂成适于序列测定的片段（300-600bp），断裂方法 有超声波处理、核酸酶 I 法和限制酶切割法。2.嵌套缺失法（nested deletion,Erase-a-base） （1）首先将大片段克隆到测序载体； （2）选用两种限制酶从待测 DNA 片段与载体序列之间将 DNA 切断,使切割后近载体端 为 3`突出的粘性末端，近待测 DNA 的末端为 5`突出的粘性末端或平端； （3）用外切核酸酶 III 消化上述线性 DNA（37°C，250 核苷酸/min），在不同时间终止 反应，可以获得在同一端缺失并依次相差 200-250bp 的 DNA 片段。 （4）用核酸酶 S1 消化末端的单链，使之成平端，经 T4 DNA 连接酶连接环化，得到 一套缺失长度不同的 DNA 片段克隆； （5）将各个克隆从其缺失端开始用通用引物测序。由于引物相同，测序结果可以从子
片段序列的相互重叠部分准确无误地将相邻片段的序列拼接起来。 原理解析 A.该法巧妙地利用cxo的酶学特征，它有35外切酶活性，它只能切dsDNA或平头 的3末端或龟缩的3末端，而不能切sDNA的3末端（即突出末端）。 B.水解速度较均匀，在37℃，每分钟可降解250个核苷酸，因此，在一定的时间间隔内 取样终止反应，可以得到依次相差200-250个碱基对的D4片段。 C.cxo能从DNA的切口处进行3一5外切，因此，样品不能有切口存在，操作时用含有 50mmol/LpH4. NaOAC (醋酸钠 )的酚代替普通的pH7.0的酚去 有切口的DNA 分于 D.exolII能被微量的NaCI强烈抑制，因此，样品DNA必须用酚/氯仿抽提和酒精沉淀。 3、引物延伸法 从DNA的3'端依赖特定引物延伸测定一段DNA序列，再根据测得序列设计新的引物， 如此逐步推进。 第二节Maxam-Gilbert化学修饰法 氧链 法建立的同时，Maxam和Gilbert于I977年建立了一种以化学修 饰为基础的DNA序列分析法，称为Maxam-Gilbert化学修饰法。 基本原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割， 由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混和物，经凝胶电泳按大小分离和放射自 显影，便可根据X线片底板上显示相应带谱，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。 化学修饰法的特测DNA片段有的是双链，有的是单鞋DN。在进行碱基特异性化学切 割反应前，首先对待测DNA片段作末端标记，使其末端（⑤'端或者是3'端）带上放射标记 如果待测DNA是双链，必须使其形成末端标记的单链。 对末端标记的DNA链进行化学断裂反应分两步进行： 第一步是在4个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸对特定的碱基进行化学 悠饰 第二步是以六氢吡啶取代被修饰的碱基并将DNA链断裂。 DNA化学裂解反应体系(P166】 反应体系 碱基修饰试剂 基修饰反应 主链断裂试剂断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌岭甲基化 六氢吡啶 G C+A 甲酸 脱嘌吟作用 六氢吡晾 G和A C+T 密啶开 六氢叫 店 C和T 肼（加盐 胞嘧啶开环 六氢吡啶 DMS(硫酸二甲酯)在中性pH环境中，主要作用于G,被六氢毗啶作用而造成该位点 上DNA链的断裂 甲酸具有脱吟作用。DNA链在脱嘌吟位点(G和)发生断裂 肼，在碱性条件下，作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个 核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的盐，同胸腺嘧啶的反应 速率便会下降，主要作用于胞嘧啶。 在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰（而
片段序列的相互重叠部分准确无误地将相邻片段的序列拼接起来。 原理解析： A.该法巧妙地利用 exoIII 的酶学特征，它有 3`®5`外切酶活性，它只能切 dsDNA 或平头 的 3`末端或龟缩的 3`末端，而不能切 ssDNA 的 3`末端（即突出末端）。 B.水解速度较均匀，在 37 °C，每分钟可降解 250 个核苷酸，因此，在一定的时间间隔内 取样终止反应，可以得到依次相差 200-250 个碱基对的 DNA 片段。 C.exoIII 能从 DNA 的切口处进行 3`→5`外切，因此，样品不能有切口存在，操作时用含有 50mmol/LpH4.0 NaOAC（醋酸钠 ）的酚代替普通的 pH7.0 的酚去除有切口的 DNA 分子。 D.exoIII 能被微量的 NaCl 强烈抑制，因此，样品 DNA 必须用酚/氯仿抽提和酒精沉淀。 3、引物延伸法 从 DNA 的 3′端依赖特定引物延伸测定一段 DNA 序列，再根据测得序列设计新的引物， 如此逐步推进。 第二节 Maxam-Gilbert 化学修饰法 一、Maxam-Gilbert 化学修饰法原理 几乎与双脱氧链终止法建立的同时，Maxam 和 Gilbert 于 1977 年建立了一种以化学修 饰为基础的 DNA 序列分析法，称为 Maxam-Gilbert 化学修饰法。 基本原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的 DNA 片段，造成碱基的特异性切割， 由此产生一组具有各种不同长度的 DNA 链的反应混和物，经凝胶电泳按大小分离和放射自 显影，便可根据 X 线片底板上显示相应带谱，直接读出待测 DNA 片段的核苷酸顺序。 化学修饰法的待测 DNA 片段有的是双链，有的是单链 DNA。在进行碱基特异性化学切 割反应前，首先对待测 DNA 片段作末端标记，使其末端(5′端或者是 3′端)带上放射标记。 如果待测 DNA 是双链，必须使其形成末端标记的单链。 对末端标记的 DNA 链进行化学断裂反应分两步进行： 第一步是在 4 个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸对特定的碱基进行化学 修饰； 第二步是以六氢吡啶取代被修饰的碱基并将 DNA 链断裂。 DNA 化学裂解反应体系（P166） 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G 和 A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C 和 T C 肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C DMS（硫酸二甲酯）在中性 pH 环境中，主要作用于 G，被六氢吡啶作用而造成该位点 上 DNA 链的断裂。 甲酸具有脱嘌呤作用。DNA 链在脱嘌呤位点(G 和 A)发生断裂。 肼，在碱性条件下，作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个 核苷酸位置上发生 DNA 链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的盐，同胸腺嘧啶的反应 速率便会下降，主要作用于胞嘧啶。 在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而
不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修 饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的 寡聚核苷酸片段 只有带标记末端的片段可被识别，没有标记 末端的片段可以忽略不计 以上4种反应体系DNA片段混合物经高分辨凝胶电泳与放射自显影，使可直接读得测 定DNA片段的碱基排列顺序。各DNA子片段测序工作完成后，按酶切图谱，可顺序相连 完成完整的长链DNA序列。 学修饰法的特点 与双脱氧链终止法相比，Maxam-Gilbert化学修饰法具有一些独到的特点 1.本法不需要体外进行酶催化的延伸反应，未经克隆的待测DNA片段也可以直接进行 序列测定： 2.对于含有稀有碱基如5-甲基腺嘌呤或G、C含量较高的DNM片段、短链的宾聚核苷酸 3,采用化学修饰 端，也可以标记3'末端，因此可以从两 个相反方向测定同一条DNA链的核苷酸顺序，测定结果可以互作参照，彼此核对。 主要缺点 1.操作比较繁琐和费时，未端核素标记效率低造成放射自显影需曝光较长时间： 2.对过长DNA链的序列测定仍比较闲难。 第三节DNA测序自动化技术 一、激光测序法（终止标记系统） 用4种不同的荧光基团分别标记4种dNT,这样测序反应就可以在一个试管中进行 终止反应的产物按终止位置碱基的不同，其3末端带有不同的荧光基团 ,被激发后发出 同的荧光，因此可以上样在一个加样孔上，电泳结束后，用DNA测序仪识别，经软件处理， 便得到待测的核苷酸序列。工作量和效率均大大提高。 二、焦磷酸测序技术的原理 焦磷酸测序技术()是1987年发展起来的一种新型的酵联级联测序技术， 其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(polymerase)入ATP硫酸化酶(sulfurylase） 荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)4种酶的协同作用下，每一个dNTP 的聚合与一次荧光信号的释放级联起来，以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序 列。它具有快速、准确、经济、实时检测的特点，不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品 进行任何特殊形式的标记和染色，有很高的可重复性、高度的并行性和高度的自动化。 具体过程： 第一步，测序引物杂交到PCR扩增的模板上，与DNA聚合酶(polymerase入、ATP硫酸 化酶(sulfurylase、入荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)加入反应体系。 第二步，加入4种dNP到反应体系中进行聚合酶链式反应，当DNA聚合酶将某一种 NTP与模板上相应的核苷酸互补聚合时，会产生相同摩尔数的焦磷酸。需要说明的是在焦 磷酸测序中 ATP不 能被光素酶识别，故用arS-dATP代替常用的dP。 第三步，在5'-腺苷磷酸硫酸化醇协调作用下ATP硫酸化酶将焦磷酸(PP)转移到 ATP上，该硫酸化的ATP驱动荧光素酶将荧光素转化成氧化荧光素，后者在荧光素酶催化下 释放出与ATP量成比例的荧光，发出的荧光信号被CCD摄像机拍摄下来，并以很尖的波峰
不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA 链并不是在所有可被修 饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在 4 个反应中，产生 4 套带相同标记末端、长短不一的 寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。 以上 4 种反应体系 DNA 片段混合物经高分辨凝胶电泳与放射自显影，便可直接读得测 定 DNA 片段的碱基排列顺序。各 DNA 子片段测序工作完成后，按酶切图谱，可顺序相连 完成完整的长链 DNA 序列。 二、Maxam-Gilbert 化学修饰法的特点 与双脱氧链终止法相比，Maxam-Gilbert 化学修饰法具有一些独到的特点。 1.本法不需要体外进行酶催化的延伸反应，未经克隆的待测 DNA 片段也可以直接进行 序列测定； 2.对于含有稀有碱基如 5-甲基腺嘌呤或 G、C 含量较高的 DNA 片段、短链的寡聚核苷酸 的序列测定，化学修饰法较双脱氧链终止法更具优越性； 3.采用化学修饰法测序时，既可以标记 5′末端，也可以标记 3′末端，因此可以从两 个相反方向测定同一条 DNA 链的核苷酸顺序，测定结果可以互作参照，彼此核对。 主要缺点 1.操作比较繁琐和费时，未端核素标记效率低造成放射自显影需曝光较长时间； 2.对过长 DNA 链的序列测定仍比较困难。 第三节 DNA 测序自动化技术 一、激光测序法（终止标记系统） 用 4 种不同的荧光基团分别标记 4 种 ddNTP,这样测序反应就可以在一个试管中进行， 终止反应的产物按终止位置碱基的不同，其 3`末端带有不同的荧光基团，被激发后发出不 同的荧光，因此可以上样在一个加样孔上，电泳结束后，用 DNA 测序仪识别，经软件处理， 便得到待测的核苷酸序列。工作量和效率均大大提高。 二、焦磷酸测序技术的原理 焦磷酸测序技术（pyrosequencing）是 1987 年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术， 其原理是：引物与模板 DNA 退火后，在 DNA 聚合酶（polymerase）、ATP 硫酸化酶（sulfurylase）、 荧光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）4 种酶的协同作用下，每一个 dNTP 的聚合与一次荧光信号的释放级联起来，以荧光信号的形式实时记录模板 DNA 的核苷酸序 列。它具有快速、准确、经济、实时检测的特点，不需要凝胶电泳，也不需要对 DNA 样品 进行任何特殊形式的标记和染色，有很高的可重复性、高度的并行性和高度的自动化。 具体过程： 第一步，测序引物杂交到 PCR 扩增的模板上，与 DNA 聚合酶（polymerase）、ATP 硫酸 化酶（sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）加入反应体系。 第二步，加入 4 种 dNTP 到反应体系中进行聚合酶链式反应，当 DNA 聚合酶将某一种 dNTP 与模板上相应的核苷酸互补聚合时，会产生相同摩尔数的焦磷酸。需要说明的是在焦 磷酸测序中，dATP 不能被荧光素酶识别，故用 a-S-dATP 代替常用的 dATP。 第三步，在 5’-腺苷磷酸硫酸化酶协调作用下 ATP 硫酸化酶将焦磷酸（PPi）转移到 ATP 上，该硫酸化的 ATP 驱动荧光素酶将荧光素转化成氧化荧光素,后者在荧光素酶催化下 释放出与 ATP 量成比例的荧光，发出的荧光信号被 CCD 摄像机拍摄下来，并以很尖的波峰
形式在pyrogram软件记录下来。每一峰高（即荧光信号强度）都与参与DNA合成的核苷 酸数成比例。 第四步，没有聚合的过剩的TP迅速被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，反应体系得以再生 随后加入另一种NTP,重复以上反应。模板序列就可以随聚合酶链式反应的进行而被同步 测定。整个测序过程没有特殊的标记、染色、电泳等烦琐的操作。 特点： 焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，目前的技术通常能满足25-30个核苷酸 的短序列测定，其重复性和精确性能与sanger DNA测序法相媲美，而速度却大大的提高 最近开发的PQ96MA和PQ96HS系统能在1小时内同时对96个样品进行SNPs分析和基因 分析，工作效率大大提高，测序成本大大降低
形式在 pyrogram 软件记录下来。每一峰高（即荧光信号强度）都与参与 DNA 合成的核苷 酸数成比例。 第四步，没有聚合的过剩的 dNTP 迅速被三磷酸腺苷双磷酸酶降解,反应体系得以再生， 随后加入另一种 dNTP，重复以上反应。模板序列就可以随聚合酶链式反应的进行而被同步 测定。整个测序过程没有特殊的标记、染色、电泳等烦琐的操作。 特点： 焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，目前的技术通常能满足 25-30 个核苷酸 的短序列测定，其重复性和精确性能与 sanger DNA 测序法相媲美，而速度却大大的提高， 最近开发的 PQ96MA 和 PQ96HS 系统能在 1 小时内同时对 96 个样品进行 SNPs 分析和基因 分析，工作效率大大提高，测序成本大大降低