8.酚提取水相的吸取：酚抽提离心后，溶液会分为上层的水相、下层的酚有机相和中 间的交界面，DNA位于上层的水相中，交界面含有蛋白。因此在吸取上层水相时应非常小 心，以免将混有交界面的蛋白质也吸入上层水相。如不慎吸取到交界面的蛋白，可再进行一 次酚抽提以去除蛋白。另外，TsC饱和酚的pH值应接近8.0，过酸或过碱都会造成酚抽 提离心后，水、酚两相交界面不清楚，交界面有DNA滞留，进而转移水相时带动界面中的 蛋白质。 9。琼脂糖凝胶电泳：倒胶时注意不能有气泡留在胶层，电泳时注意正负极的方向不能 接反。用于凝胶染色的溴化乙锭为致癌物，操作时一定要戴乳胶或一次性手套。溴化乙锭可 在制备凝胶时直接加入凝胶中，或者加入电泳槽中的电泳缓冲液中，这样在电泳结束后可直 接观察：也可以等电泳结束后单独进行溴化乙锭染色。 【思考题】 1.什么是基因组DNA? 2.常用的三种基因组DNA提取方法的原理是什么？ 3.紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度原理是什么？ 4.酚/氯仿法抽提DNA时，酚为什么要进行饱和？酚、氯仿、异戊醇和蛋白酶K分别 起什么作用？ 实验二、总RNA的提取制备与检测 【实验目的】 I.了解RNA分子的种类、分布及其结构特点 2.掌握总RNA提取的基本原理和实验方法 3.掌握总RNA浓度检测的方法 4.掌握总RNA完整性检测的方法 【实验原理】 RNA是生物体内除DNA之外的另一大类核酸，其结构与DNA十分类似，也是由核苷 酸单元以3,5磷酸二酯健连接而成的长而无分枝的大分子。然而与DNA相比，RNA分子 量则较小，通常由几十至几千个核苷酸单元组成。除某些病毒外，生物体内的RNA通常以 单链的形式存在，但单链的RNA可以通过局部区域内的自身配对形成双螺旋结构，不能配 对区域则形成环状突起。生物体内的RNA主要分为rRNA、tRNA、mRNA和其它一些小
8． 酚提取水相的吸取：酚抽提离心后，溶液会分为上层的水相、下层的酚有机相和中 间的交界面，DNA 位于上层的水相中，交界面含有蛋白。因此在吸取上层水相时应非常小 心，以免将混有交界面的蛋白质也吸入上层水相。如不慎吸取到交界面的蛋白，可再进行一 次酚抽提以去除蛋白。另外，Tris.Cl 饱和酚的 pH 值应接近 8.0，过酸或过碱都会造成酚抽 提离心后，水、酚两相交界面不清楚，交界面有 DNA 滞留，进而转移水相时带动界面中的 蛋白质。 9． 琼脂糖凝胶电泳：倒胶时注意不能有气泡留在胶层，电泳时注意正负极的方向不能 接反。用于凝胶染色的溴化乙锭为致癌物，操作时一定要戴乳胶或一次性手套。溴化乙锭可 在制备凝胶时直接加入凝胶中，或者加入电泳槽中的电泳缓冲液中，这样在电泳结束后可直 接观察；也可以等电泳结束后单独进行溴化乙锭染色。 【思考题】 1． 什么是基因组 DNA？ 2． 常用的三种基因组 DNA 提取方法的原理是什么？ 3． 紫外分光光度法检测 DNA 浓度和纯度原理是什么？ 4． 酚/氯仿法抽提 DNA 时，酚为什么要进行饱和？酚、氯仿、异戊醇和蛋白酶 K 分别 起什么作用？ 实验二、总 RNA 的提取制备与检测 【实验目的】 1． 了解 RNA 分子的种类、分布及其结构特点 2． 掌握总 RNA 提取的基本原理和实验方法 3． 掌握总 RNA 浓度检测的方法 4． 掌握总 RNA 完整性检测的方法 【实验原理】 RNA 是生物体内除 DNA 之外的另一大类核酸，其结构与 DNA 十分类似，也是由核苷 酸单元以 3',5'-磷酸二酯键连接而成的长而无分枝的大分子。然而与 DNA 相比，RNA 分子 量则较小，通常由几十至几千个核苷酸单元组成。除某些病毒外，生物体内的 RNA 通常以 单链的形式存在，但单链的 RNA 可以通过局部区域内的自身配对形成双螺旋结构，不能配 对区域则形成环状突起。生物体内的 RNA 主要分为 rRNA、tRNA、mRNA 和其它一些小
RNA分子等几大类，其中rRNA的含量最高，约80%~85%，其次为RNA,约为I0%~ 15%,mRNA的含量较低，约为1%~5%。RNA分子在细胞内也是以核蛋白的形式存在，故 而也要在抽提时先进行解聚处理。 RNA作为细胞内一类重要的核酸分子和分子生物学研究的一个主要对象，进行完整的 RNA的提取和纯化是进行RNA方面研究工作的基本前提，如Northem杂交、mRNA分离、 RT-PCR、基因表达水平检测、cDNA合成及体外转录和翻译等实验均需要首先得到高质量 的RNA样品。 RNA提取的基本策略和步骤与DNA的提取也基本类似，只不过在提取RNA时，DNA 则作为一种杂质被除去。RNA提取的基本步骤为首先破碎细胞，然后去除与RNA结合的蛋 白质以及多糖、脂类、DNA等生物大分子，沉淀RNA,去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化 RNA等。一般方法提取的都仅仅是组织细胞内的总RNA,但个别研究工作中还要获取纯的 mRNA,则需进行进一步的分离纯化。 总RNA的分离提取方法目前主要有两种，即酸性异硫氰酸肌-酚-氯仿一步法和异硫氰 酸弧-CsC超速离心法。异硫氰酸弧-CsC超速离心法提取出的总RNA质量较高，但该法费 时且需要高速离心。酸性异硫氰酸胍酚氯仿一步法则是最为经典的RNA分离纯化方法， 于1987年由Chomezynski等人建立，故也称Chomezynski一步分离法，该法以含有异硫氟 酸肌、B巯基乙醇和SDS的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的酸性条件下，再加入酚和 氯仿，经离心分离后DNA与蛋白质进入有机相而RNA则留在水相，从而将总RNA抽提出 来，最后吸取水相用异丙醇沉淀获得总RNA。与其它方法相比，Chomczynski一步分离法 具有简便、经济、快速和高效等特点，且用该法制备的总RNA适用于绝大多数分子生物学 实验如Northern杂交等的要求，因此成为目前使用最为广泛的RNA提取方法，适用于从培 养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。在该方法的基础上，很多生物技术公司也开 发出了更加便于使用的用于RNA分离的商品溶液，从而使得RNA的分离纯化变得更为快 捷和容易。如Invitrogen公司的TRIZOL试剂就是在Chomezynski一步分离法基础上进行改 进的复合试剂，含有异硫氰酸肌和酚等化学试剂，可迅速破坏细胞结构，使RNA核蛋白解 离并将RNA分子释放到溶液中。 另外，在RNA的提取过程中，我们最关心的便是其一级结构的稳定性，尤其是来自于 细胞内外环境中的RNase对其一级结构的降解。与DNse相比，RNae分布广泛，耐热耐 酸耐碱，不需要辅助因子，蛋白质变性剂也只能暂时抑制它的活性。所以，RNA分离纯化 的关键问题就是创造一个无RNase的环境。创造一个无RNase的环境主要包括两方面的工
RNA 分子等几大类，其中 rRNA 的含量最高，约 80％～85%，其次为 tRNA，约为 10％～ 15％，mRNA 的含量较低，约为 1%~5%。RNA 分子在细胞内也是以核蛋白的形式存在，故 而也要在抽提时先进行解聚处理。 RNA 作为细胞内一类重要的核酸分子和分子生物学研究的一个主要对象，进行完整的 RNA 的提取和纯化是进行 RNA 方面研究工作的基本前提，如 Northern 杂交、mRNA 分离、 RT-PCR、基因表达水平检测、cDNA 合成及体外转录和翻译等实验均需要首先得到高质量 的 RNA 样品。 RNA 提取的基本策略和步骤与 DNA 的提取也基本类似，只不过在提取 RNA 时，DNA 则作为一种杂质被除去。RNA 提取的基本步骤为首先破碎细胞，然后去除与 RNA 结合的蛋 白质以及多糖、脂类、DNA 等生物大分子，沉淀 RNA，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化 RNA 等。一般方法提取的都仅仅是组织细胞内的总 RNA，但个别研究工作中还要获取纯的 mRNA，则需进行进一步的分离纯化。 总 RNA 的分离提取方法目前主要有两种，即酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法和异硫氰 酸弧-CsCl 超速离心法。异硫氰酸弧-CsCl 超速离心法提取出的总 RNA 质量较高，但该法费 时且需要高速离心。酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法则是最为经典的 RNA 分离纯化方法， 于 1987 年由 Chomczynski 等人建立，故也称 Chomczynski 一步分离法，该法以含有异硫氰 酸胍、β-巯基乙醇和 SDS 的变性溶液裂解细胞，然后在 pH4.0 的酸性条件下，再加入酚和 氯仿，经离心分离后 DNA 与蛋白质进入有机相而 RNA 则留在水相，从而将总 RNA 抽提出 来，最后吸取水相用异丙醇沉淀获得总 RNA。与其它方法相比，Chomczynski 一步分离法 具有简便、经济、快速和高效等特点，且用该法制备的总 RNA 适用于绝大多数分子生物学 实验如 Northern 杂交等的要求，因此成为目前使用最为广泛的 RNA 提取方法，适用于从培 养细胞和大多数动物组织中分离纯化总 RNA。在该方法的基础上，很多生物技术公司也开 发出了更加便于使用的用于 RNA 分离的商品溶液，从而使得 RNA 的分离纯化变得更为快 捷和容易。如 Invitrogen 公司的 TRIZOL 试剂就是在 Chomczynski 一步分离法基础上进行改 进的复合试剂，含有异硫氰酸胍和酚等化学试剂，可迅速破坏细胞结构，使 RNA 核蛋白解 离并将 RNA 分子释放到溶液中。 另外，在 RNA 的提取过程中，我们最关心的便是其一级结构的稳定性，尤其是来自于 细胞内外环境中的 RNase 对其一级结构的降解。与 DNase 相比，RNase 分布广泛，耐热耐 酸耐碱，不需要辅助因子，蛋白质变性剂也只能暂时抑制它的活性。所以，RNA 分离纯化 的关键问题就是创造一个无 RNase 的环境。创造一个无 RNase 的环境主要包括两方面的工
作：即极力避免外源RNase的污染和尽力抑制内源性RNase的活力。外源RNase主要来源 于操作者的手、实验器皿和试剂，故而口罩、手套、实验器皿、试剂要高温高压灭菌处理， 或焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate,DEPC)处理。内源性RNase来源于样品中的组织 细胞，细胞破碎的同时，RNS也随即释放出来，所以原则上要尽可能早的去除细胞内蛋白， 联合使用各种不同的强有力的RNase抑制剂。 本实验中我们将主要介绍如何使用Chomczynski一步分离法来分离总RNA,同时考虑 到TRIZOL试剂的广泛使用，也提供TRIZOL试剂的使用方法作为可选方案 【实验材料】 1.仪器： 恒温水浴箱，台式冷冻高速离心机，紫外分光光度计，电泳仪，电泳槽，l.5 ml Eppendorf 管，剪刀，牙签，移液器，吸头，锥形瓶，微波炉，简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统等 2.试剂： (1)磷酸盐缓冲液(PBS):NaC18g,KC0.2g,Na:HPO,1.44g,KHPO40.24g, 800ml蒸馏水溶解，用HC1调节pH至7.4，加水定容至1L,高压蒸气灭菌20mim,保存 于室温。 (2)变性液：4molL异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠(pH7),0.5%(m/V)SDS。 (3)5×MOPs溶液：20.9 g MOPS[3.(N-玛琳代)丙磺酸，3.(N-morpholine) propanesulonicacid],溶于500 ml DEPC处理过的水中，加0,5mol/L EDTA(pH8.0)10ml, 混匀后加入3mo/L乙酸钠(pH5.2)25ml,定容至1L,避光保存于4℃，若溶液变黄则丢 弃。 (4)苯酚：熏蒸后，用0.5 mol/LTis.Cl(pH8.0)平衡。 (5)491(VN)氯仿/异戊醇 (6)TRIzol试剂 (7)其它试剂：DEPC,氯仿，异丙醇，2moL醋酸钠(pH4),95%乙醇，75%乙 醇(DEPC处理水配制)，溴化乙锭溶液，甲醛，甲酰胺，琼脂糖，RNA分子量参照物，RNA 加样缓冲液等。 (8)组织和细胞：贴壁或悬浮培养的哺乳动物细胞、新鲜组织。 【实验步骤】 (一)RNA的提取(Chomczynski一步分离法) 1.组织细胞样品的处理：
作：即极力避免外源 RNase 的污染和尽力抑制内源性 RNase 的活力。外源 RNase 主要来源 于操作者的手、实验器皿和试剂，故而口罩、手套、实验器皿、试剂要高温高压灭菌处理， 或焦碳酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理。内源性 RNase 来源于样品中的组织 细胞，细胞破碎的同时，RNase 也随即释放出来，所以原则上要尽可能早的去除细胞内蛋白， 联合使用各种不同的强有力的 RNase 抑制剂。 本实验中我们将主要介绍如何使用 Chomczynski 一步分离法来分离总 RNA，同时考虑 到 TRIZOL 试剂的广泛使用，也提供 TRIZOL 试剂的使用方法作为可选方案。 【实验材料】 1． 仪器： 恒温水浴箱，台式冷冻高速离心机，紫外分光光度计，电泳仪，电泳槽，1.5 ml Eppendorf 管，剪刀，牙签，移液器，吸头，锥形瓶，微波炉，简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统等。 2． 试剂： （1） 磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g， 800 ml 蒸馏水溶解，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加水定容至 1 L，高压蒸气灭菌 20 min，保存 于室温。 （2） 变性液：4 mol/L 异硫氰酸胍，25 mmol/L 柠檬酸钠（pH7），0.5％（m/V）SDS。 （3） 5×MOPS 溶液：20.9 g MOPS [3-（N-玛琳代）丙磺酸，3-（N-morpholinc） propanesulonic acid]，溶于 500 ml DEPC 处理过的水中，加 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）10 ml， 混匀后加入 3 mol/L 乙酸钠（pH5.2）25 ml，定容至 1 L，避光保存于 4℃，若溶液变黄则丢 弃。 （4） 苯酚：熏蒸后，用 0.5 mol/L Tis•Cl（pH8.0）平衡。 （5） 49:1（V/V）氯仿/异戊醇 （6） TRIzol 试剂 （7） 其它试剂：DEPC，氯仿，异丙醇，2 mol/L 醋酸钠（pH4），95％乙醇，75％乙 醇（DEPC 处理水配制），溴化乙锭溶液，甲醛，甲酰胺，琼脂糖，RNA 分子量参照物，RNA 加样缓冲液等。 （8） 组织和细胞：贴壁或悬浮培养的哺乳动物细胞、新鲜组织。 【实验步骤】 （一）RNA 的提取（Chomczynski 一步分离法） 1． 组织细胞样品的处理：
(1)组织样本：将组织适当剪碎，按照每100mg组织加入1ml变性液，然后在玻璃 匀浆器中将组织匀浆。或者使用液氮在研体中研碎组织后再加入变性液。 (2)细胞样本：应尽可能收集生长状态良好的正在培养的细胞即行抽提，不能及时 提取时，则须将细胞放于液氮或-80℃冰箱保存。对于悬浮培养细胞，经1000g离心5m 收集细胞，然后加入变性液混悬细胞沉淀。对于贴壁培养细胞，则需倒出培养皿中的培养液， 用预冷的PBS洗2次，将变性液直接加入培养皿中。变性液的使用量为1×10？个细胞ml。 2.取500山经过变性液处理过的组织细胞裂解物移至另一新管中，然后加入50l2 molL的酯酸钠、500l的饱和酚，50l的氯仿/异戊醇(49：1)，混匀后冰上放置15min。 3.12,000g4C离心15min。将上层含RNA的水相转移至一新的离心管中，然后加 入与500ul的异丙醇，充分混合，置于-20℃30min或-70℃5min以沉淀RNA。 4.12,000g4℃离心10min,收集RNA沉淀。 5.离心后轻轻倒出异丙醇，加入200ul的变性液溶解RNA沉淀。然后加入200山l 的异丙醇和60ul的2molL的乙酸钠，置于-20℃30min或-70C5min以沉淀RNA。 6.12,000g4C离心20min,收集RNA沉淀。加入75%乙醇重悬洗涤RNA沉淀， 然后12,000g4℃离心5min再次收集RNA沉淀。 7.晾干或真空干燥RNA沉淀，然后加入50 HI DEPC处理过的水以溶解RNA。溶于 水的RNA贮存于一70C备用。 (二)RNA的提取（备选方案：TRIzol试剂法） 1.组织细胞的匀浆处理 组织样品：按照每50mg~100mg组织样品加入1 ml TRIzol试剂，用玻璃匀浆器或者 电动匀浆器破碎组织细胞： 细胞样品：对于贴壁细胞，吸去培养基后，用PBS洗涤一次，以洗去残留的培养基， 然后按照每10cm面积加入1mlTR1zol试剂的比例将TRI2ol试剂直接加至培养皿，用移液 器上下吹打几次以裂解细胞：对于悬浮细胞，首先应收集细胞沉淀，然后按照每10的个细胞 加入1 ml TRIzol试剂的比例加入TRIzol试剂，用移液器上下吹打几次以裂解细胞。 将上述经TRIz0l处理的组织细胞裂解液转移至一新的15ml离心管中。 2.对于多糖、蛋白质、脂肪或者细胞外基质等含量高的组织细胞样品，需将经Tz0 处理的组织细胞裂解液进行离心处理以去除这些物质，12,000g于2~8℃离心10min,收 集上清。对于一般的组织细胞样品，可省略该步骤直接进入下一步。 3.将上述经TRI2ol处理的组织细胞裂解液于室温下放置5min。然后按照每1ml
（1） 组织样本：将组织适当剪碎，按照每 100 mg 组织加入 1 ml 变性液，然后在玻璃 匀浆器中将组织匀浆。或者使用液氮在研钵中研碎组织后再加入变性液。 （2） 细胞样本：应尽可能收集生长状态良好的正在培养的细胞即行抽提，不能及时 提取时，则须将细胞放于液氮或－80℃冰箱保存。对于悬浮培养细胞，经 1000 g 离心 5 min 收集细胞，然后加入变性液混悬细胞沉淀。对于贴壁培养细胞，则需倒出培养皿中的培养液， 用预冷的 PBS 洗 2 次，将变性液直接加入培养皿中。变性液的使用量为 1×107 个细胞/ml。 2． 取 500 µl 经过变性液处理过的组织细胞裂解物移至另一新管中，然后加入 50 µl 2 mol/L 的醋酸钠、500 µl 的饱和酚，50 µl 的氯仿/异戊醇（49:1），混匀后冰上放置 15 min。 3． 12，000 g 4℃离心 15 min。将上层含 RNA 的水相转移至一新的离心管中，然后加 入与 500 µl 的异丙醇，充分混合，置于－20℃ 30 min 或－70℃ 5 min 以沉淀 RNA。 4． 12，000 g 4℃离心 10 min，收集 RNA 沉淀。 5． 离心后轻轻倒出异丙醇，加入 200 µl 的变性液溶解 RNA 沉淀。然后加入 200 µl 的异丙醇和 60 µl 的 2 mol/L 的乙酸钠，置于－20℃ 30 min 或－70℃ 5 min 以沉淀 RNA。 6． 12，000 g 4℃离心 20 min，收集 RNA 沉淀。加入 75％乙醇重悬洗涤 RNA 沉淀， 然后 12，000 g 4℃离心 5 min 再次收集 RNA 沉淀。 7． 晾干或真空干燥 RNA 沉淀，然后加入 50 µl DEPC 处理过的水以溶解 RNA。溶于 水的 RNA 贮存于－70℃备用。 （二）RNA 的提取（备选方案：TRIzol 试剂法） 1． 组织细胞的匀浆处理 组织样品：按照每 50 mg～100 mg 组织样品加入 1 ml TRIzol 试剂，用玻璃匀浆器或者 电动匀浆器破碎组织细胞； 细胞样品：对于贴壁细胞，吸去培养基后，用 PBS 洗涤一次，以洗去残留的培养基， 然后按照每 10 cm2 面积加入 1 ml TRIzol 试剂的比例将 TRIzol 试剂直接加至培养皿，用移液 器上下吹打几次以裂解细胞；对于悬浮细胞，首先应收集细胞沉淀，然后按照每 106 个细胞 加入 1 ml TRIzol 试剂的比例加入 TRIzol 试剂，用移液器上下吹打几次以裂解细胞。 将上述经 TRIzol 处理的组织细胞裂解液转移至一新的 1.5 ml 离心管中。 2． 对于多糖、蛋白质、脂肪或者细胞外基质等含量高的组织细胞样品，需将经 TRIzol 处理的组织细胞裂解液进行离心处理以去除这些物质，12,000 g 于 2～8℃离心 10 min，收 集上清。对于一般的组织细胞样品，可省略该步骤直接进入下一步。 3． 将上述经 TRIzol 处理的组织细胞裂解液于室温下放置 5 min。然后按照每 1 ml
TR1ZOL试剂加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿，刷烈振荡15秒，于室温下放置2min~3min。 4.4℃下12000g离心15min. 5.将水相转移至一新离心管中。每1 ml TRIzo0l中加入0.5ml异丙醇沉淀RNA。混匀， 将样品置于室温下l0min。 6.于4℃，12000g离心10min。凝胶样沉淀物为RNA。 7.弃去上清液并用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，随后于4℃下7500g离心5min。 8.晾干RNA沉淀，然后用适量DEPC水溶解沉淀。 9.分别取出2u1测定浓度、纯度及质量，剩余的RNA加入1/10体积乙酸钠和1ml 无水乙醇重新沉淀，保存在0℃备用。 (三)RNA的浓度和纯度检测 取适量RNA样品，用DEPC处理水进行稀释，DEPC处理水作为空白对照，采用紫外 分光光度计测定A0和A0值，同时计算A2/A280比值以推测RNA样品的纯度。按照下面 公式计算DNA样品的浓度： RNA浓度(ugμl)=A26×40×稀释倍数/1000 纯的RNA制品的A@A0比值应接近2.0。如低于1.7，表明可能存在蛋白质污染，可 以通过重复酚/氯仿抽提以去除蛋白质。 (四)RNA的完整性检测一一甲变性琼脂糖腰胶电泳 1.甲醛变性胶的制备：称取1g琼脂糖于锥形瓶中，在73m蒸馏水中溶解后稍冷却， 加入20ml5 XMOPS缓冲液，17ml甲醛。微波炉加热使琼脂糖完全溶解。同时准备凝胶模 具并插上梳子。待胶液冷却至60℃左右后，将琼脂糖胶液倒入准备好的凝胶模具中，避免 气泡产生，若有气泡产生可用移液器吸头移去。凝胶厚度一般为0.3~0.5cm。室温下静置 20~30mi左右，待琼脂糖胶液完全凝周。胶凝之后，轻轻移去梳子。 2.RNA样品的制备： RNa 5.5ul 5xMOPS 2.0l 37%甲醛 3.5pl 甲酰胺 10.0l 总体积 20l 65℃温育15min使RNA变性，然后迅速置于冰上冷却，稍离心。 3.上样：将凝胶置于胶板模具上，放在电泳槽内，注入适量的1×MOPS电泳缓冲液
TRIZOL 试剂加入 0.2 ml 氯仿的比例加入氯仿，剧烈振荡 15 秒，于室温下放置 2 min～3 min。 4． 4℃下 12000 g 离心 15 min。 5． 将水相转移至一新离心管中。每 1 ml TRIzol 中加入 0.5 ml 异丙醇沉淀 RNA。混匀， 将样品置于室温下 10 min。 6． 于 4℃，12000 g 离心 10 min。凝胶样沉淀物为 RNA。 7． 弃去上清液并用 75%乙醇洗涤 RNA 沉淀一次，随后于 4℃下 7500 g 离心 5 min。 8． 晾干 RNA 沉淀，然后用适量 DEPC 水溶解沉淀。 9． 分别取出 2 μl 测定浓度、纯度及质量，剩余的 RNA 加入 1/10 体积乙酸钠和 1 ml 无水乙醇重新沉淀，保存在-70℃备用。 （三）RNA 的浓度和纯度检测 取适量 RNA 样品，用 DEPC 处理水进行稀释，DEPC 处理水作为空白对照，采用紫外 分光光度计测定 A260 和 A280 值，同时计算 A260/A280 比值以推测 RNA 样品的纯度。按照下面 公式计算 DNA 样品的浓度： RNA 浓度（µg/µl）=A260×40×稀释倍数/1000 纯的 RNA 制品的 A260/A280 比值应接近 2.0。如低于 1.7，表明可能存在蛋白质污染，可 以通过重复酚/氯仿抽提以去除蛋白质。 （四）RNA 的完整性检测――甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 1． 甲醛变性胶的制备：称取 1 g 琼脂糖于锥形瓶中，在 73 ml 蒸馏水中溶解后稍冷却， 加入 20 ml 5×MOPS 缓冲液，17 ml 甲醛。微波炉加热使琼脂糖完全溶解。同时准备凝胶模 具并插上梳子。待胶液冷却至 60℃左右后，将琼脂糖胶液倒入准备好的凝胶模具中，避免 气泡产生，若有气泡产生可用移液器吸头移去。凝胶厚度一般为 0.3～0.5cm。室温下静置 20～30 min 左右，待琼脂糖胶液完全凝固。胶凝之后，轻轻移去梳子。 2． RNA 样品的制备： RNA 5.5 μl 5×MOPS 2.0 μl 37%甲醛 3.5 μl 甲酰胺 10.0 μl 总体积 20 μl 65℃温育 15 min 使 RNA 变性，然后迅速置于冰上冷却，稍离心。 3． 上样：将凝胶置于胶板模具上，放在电泳槽内，注入适量的 1×MOPS 电泳缓冲液