第十-章DNA的生物合成 928个氨基酸残基的多肽链构成，分子量109kDa,由18个α螺旋区组成。用蛋白酶能将其水解为大小 两个片段，大片段保留了5'+3'方向的聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶活性，称为Klenow片段(Klenow fragmen),是基因工程中常用的一种工具酶：小片段具有5'一→3'核酸外切酶活性。DNA polⅡ也只有 条多肽链，分子量120kDa,具有5'3'方向的聚合酶活性和3'一→5'核酸外切酶活性，它在大肠杆菌DNA 复制中的作用尚不明确，可能主要参与DNA的校正修复过程。DNA polⅢ是DNA复制中起主要作用的 酶，分子量大约为1MDa,由十种亚基组成不对称的二聚体，主要包括2个核心酶、1个Y复合物和1对B 亚基（图117）。其中核心酶的主要作用是合成DNA:复合物且有促讲全髓组装至模板上及增强核心 酶活性的作用；两个B亚基能使DNA聚合酶稳定地结合在DNA模板上，在复制叉高速解链的过程中也 不至于脱落。DNA polⅢ活性高于其他DNA聚合酶，每分钟大约能催化10次聚合反应。 表111原核生物的DNA聚合裤 DNA聚合酶 功能 DNA-pol I 填补缺口，校正修复 DNA-pol II 尚不明确，可能参与DNA的修复 DNA-palⅢ 催化链的延长，复制中主要的酶 核心酶 柔性连接区 图117大肠杆菌B.coli DNA-polⅢ全酶分子结构 在真核生物中发现的DNA聚合酶大约有15种，其中主要的有α、B、Y、8、e五种。在链的延长过程 中起主要作用的是DNA聚合酶8，它主要参与冈崎片段的延长及前导链的合成；DNA聚合酶B主要参 与DNA的损伤与修复；DNA聚合酶e主要参与DNA的校正修复；DNA聚合酶Y主要参与线粒体DNA 的复制 阿糖胞苷(Cytosine arabinoside,Aa-C)在体内能转变为阿糖胞苷三磷酸(Ara-CTP),Ara-CTP能竞争 性抑制DNA聚合酶，从而抑制DNA合成，因而阿糖胞苷具有抗病毒、抗癌的作用。 二、拓扑异构酶 DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),简称为拓扑酶，可改变DNA分子的拓扑性质。拓扑，在物理 学上是指物体或图像作弹性位移而又保持物体不变的性质，所有DNA的拓扑性相互转换均需D八A链 暂时断裂和再连接。复制过程中，DNA分子每复制10p,未解开的双螺旋就会绕其长轴旋转一周，产生 正超螺旋。随着复制叉的不断前行，D八A分子将变得更加正超螺旋化，DNA链将会出现缠绕、打结等现 象，复制也无法继续进行。这时就需要拓扑酶来发挥作用，它能在DNA复制过程中消除DNA复制时局 255
第三篇遗传信息传递及其调控 部双棒解开产生的应力，将DNA转变为负超螺旋，理顺DNA结。 拓扑酶的作用特点是既能切断3'，5'磷酸二酯键，使DNA超螺旋在解旋过程中不至于缠绕打结 又能在适当的时候重新形成3'，5'磷酸二酯键，封闭切口。原核及真核生物的拓扑酶均分为I型和川 型。拓扑酶I能切断DNA双链中的一股，使DNA在解桂时程中不至于发生缠绕打结，话当时候又能 闭切口，其作用不需要消耗ATP;拓扑酶Ⅱ则是切断处于正超螺旋的DA双链，通过切口消除应力使起 螺旋松弛，利用ATP提供的能量使松弛的DNA转变为负超螺旋，双链切口也会被拓扑酶Ⅱ重新封闭 (图11-8) 8- 图1I8DNA拓扑异构酶Ⅱ作用示意图 拓扑异构酶也是抗癌药物作用的靶点，拓扑异构酶抑制剂能阻断拓扑异构酶与DNA的作用，阻止 DNA链的重新组装，引起DNA双链的断裂。拓扑异构酶I抑制剂代表药物有伊立替康(Irinotecan)、拓 扑替康(Topotecan)等。拓扑异构酶Ⅱ抑制剂代表药物有依托泊苷(Etoposide)、替尼泊苷 (Teniposide)等。 三、解螺旋酶 大肠杆菌中的DnaB蛋白又称为解螺旋酶(helicase),主要作用是利用ATP提供的能量解开双螺旋 的DNA,形成单链作为DNA复制的模板。在大肠杆菌中所发现的与复制相关的蛋白质被命名为Da DnaB、DnaC.DnaX等，DNA解链除了需要DnaB蛋白，还需要DnaA蛋白和DnaC蛋白的协同作用。 四、引物酶 由于DNA聚合酶不能催化两个游离单核苷酸之间形成3'，5'-磷酸二酯键，因此，在DNA新链合成 之前需要先合成一小段RNA片段作为引物，其长度约为10~200个核苷酸。引物的形成需由引物酶 (primas)催化完成，原核生物中的引物酶又称为DnaG蛋白，真核生物DNA聚合酶a的一个亚基就具 有引物酶的活性。 五、DNA连接酶 双链DNA分子中一条单链上的断裂部位，称为切口(niCk),它不涉及核苷酸的缺失或双链的断开 DNA连接酶(DNA ligase)能利用ATP提供的能量，将双链DNA分子中出现的单链切口连接起来。DN 复制过程中，后随链的合成是不连续的。因此，冈崎片段之间会存在很多的切口，需要DNA连接酶将冈 崎片段连接形成完整的长链，最后才能复制出完整的双链子代DNA分子（图119）。 256
第十一章DNA的生物合成 A P HO 连接酶 HO -P5 -ATP ADP -p5 0 碑的催化反应 DNA连接酶不仅在复制中发挥作用，在DNA损伤修复、重组等生理过程中也是必不可少的，也是 基因工程中一种重要的工具酶。 六、单链DNA结合蛋白 单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding protein,SSB)对单链DNA有较高亲和力，能特异 地结合到解开的DNA单链模板上，保持单模板的稳定性。复制中的两条单链模板是由一个双链DNA 分子解链后形成的，两者为互补链，碱基完全配对，因此很容易重新结合形成双链结构。另外，出现的单 链DNA分子有可能会被细胞内的核酸酶误认为是损伤的DNA而被水解。通过SSB及时结合到解开的 单链模板上，能避免以上两种情况的发生，从而保持单链模板的稳定。在真核生物中，复制蛋白A(印 lication protein A,RPA)也会结合到单链DNA模板上，保持模板的稳定。 DNA复制过程中还需要其他多种蛋白质的参与，以上介绍的六种是最主要的，其名称和功能总结 如表112。 表112参与原核生物DNA复制的主要酶类和蛋白质 名称 作用 m 合成DNA链，切除引物、校正修复 松解超螺旋，理顺DNA链 解螺旋酶(DnaB蛋白) 解开双摆旋 单链DNA结合蛋白 稳定单链模板 引物箭(DmaG蛋白 合成引物 DNA连接酶 连接冈崎片段 除了需要以上的酶和蛋白质因子，复制过程需要DNA作为模板，亲代DNA分子必须要解链成为单 链分子才能指导新链的合成。此外，还需要原料dNTP,即dATP,dGTP,dCTP和dTTP 第三节DNA复制的过程 原核生物和真核生物单个复制子的复制过程大致相似，都分为起始、延长、终止三个阶段，在原核和 真核生物中起始和终止阶段差异较大。 257