ATOGTGTCACCTAOAT AGCTTGGCG TAATCATGGTCATAGCT 00 110 120 困5.5荧光检测双脱氧法产生的寡核酸片段。四个链终止双脱氧核苷酸用不同颜色的荧光 标签标记（如红色标记T)。色谱图中一种颜色表示一种核苷酸。 固相自动法能合成DNA探针 如同多肽，依次添加活化单体至不溶性载体交联的生长链能够合成DNA链。活化单体 是质子化的脱氧核苷3-亚磷酰胺。第1步，加入的脱氧核苷3'-亚磷酰胺的3”磷原子与生长 链的5-0原子连接，形成亚磷酸三酯（图5.6)。加入的脱氧核苷3-亚磷酰胺5'OH被二甲 氧三苯甲基(DMT)保护，不参与这个连接反应。3”磷酰基与B-氛乙基(B-CE)结合，没有 反应活性。类似地，嘌呤和嘧啶碱基环上的氨基也需要保护。 Dimethoxytrityl DMT]group base(protected) CH B-Cyanoethyl Hz (BCE)group 一C CH NC一2 Aaoreneminu ” 在无水条件下进行缩合反应（因为水能够与亚磷酰胺发生反应）。第二步，用碘氧化亚 磷酸三酯，生成磷酸三酯(（五价磷)。第三步，二氯乙酸脱去生长链5OH的保护基团DMT, 但不影响其它保护基团。现在DNA合成已经完成一个核苷酸延长，可以进行下一轮操作。 每延长一个核苷酸耗时10分钟，延伸效率超过99%。 basen-1 basen basen-1 Activated monomer Growing chain hosphite triester intermediate by lz basen-1 ③ Deprotection cetic acid Elongated chain Phosphotriester intermediate 总 图5.6亚磷酸三酯法固相合成DNA链。加成到生长链的活化单体是脱氧核苷3'-亚磷酰胺， 其5-OH用DMT保护，3'磷氧原子用B-CE保护，还有一个保护基团保护碱基环上的胺基
图 5.5 荧光检测双脱氧法产生的寡核酸片段。四个链终止双脱氧核苷酸用不同颜色的荧光 标签标记（如红色标记 T）。色谱图中一种颜色表示一种核苷酸。 固相自动法能合成 DNA 探针 如同多肽，依次添加活化单体至不溶性载体交联的生长链能够合成 DNA 链。活化单体 是质子化的脱氧核苷 3'-亚磷酰胺。第 1 步，加入的脱氧核苷 3'-亚磷酰胺的 3'-磷原子与生长 链的 5'-O 原子连接，形成亚磷酸三酯（图 5.6）。加入的脱氧核苷 3'-亚磷酰胺 5'-OH 被二甲 氧三苯甲基（DMT）保护，不参与这个连接反应。3'-磷酰基与氰乙基（CE)结合，没有 反应活性。类似地，嘌呤和嘧啶碱基环上的氨基也需要保护。 在无水条件下进行缩合反应（因为水能够与亚磷酰胺发生反应）。第二步，用碘氧化亚 磷酸三酯，生成磷酸三酯（五价磷）。第三步，二氯乙酸脱去生长链 5'-OH 的保护基团 DMT， 但不影响其它保护基团。现在 DNA 合成已经完成一个核苷酸延长，可以进行下一轮操作。 每延长一个核苷酸耗时 10 分钟，延伸效率超过 99%。 图 5.6 亚磷酸三酯法固相合成 DNA 链。加成到生长链的活化单体是脱氧核苷 3'-亚磷酰胺， 其 5'-OH 用 DMT 保护，3'-磷氧原子用CE 保护，还有一个保护基团保护碱基环上的胺基
由于所需产物连接在不溶性支持物上，只是在延伸结束后才从支持物释放出来，因此固 相方法是化学合成DNA、多肽的理想途径。所有反应都在一个反应器中进行，可以加入过 量试剂驱使化学反应彻底进行。每步反应之后，可以洗去溶剂和副产物。反应结束后，用氨 水处理能够释放合成的寡核苷酸，并除去所有的保护基团。由于延伸反应不能超过100%， 合成链的长度不一致。最长的寡核苷酸分子就是我们需要的合成产物。合成产物可以用 HPLC或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。用固相方法曾经合成了长度达到100核苷酸的DNA链。 能够迅速合成各种序列的DNA链使我们能够开展很多研究。例如合成寡核苷酸的末端 用P或荧光基团标记可以用来搜寻很长DNA分子或含有很多染色体的基因组中某段互补 的DNA序列，用标记寡核苷酸作为探针使用很有效，也很普及。例如，能够与人色体上某 段序列互补的DNA探针可以用来探讨染色体上相邻DNA。用该探针作为引物进行PCR扩 增能获得相邻的DNA片段。DNA化学合成技术能够制造新基因。已经有很多实例利用合 成基因表达生产具有新特性的蛋白质。 聚合酶链式反应(PCR)能选择性扩增DNA序列 I984年Kary Mullis设计了聚合酶链式反应(PCR)扩增特意的DNA序列。DNA分子 是连续的DNA双链。我们所要扩增的DNA序列（即目标序列）两侧有非目标DNA序列。 如果目标序列两侧的DNA序列已知就能用PCR扩增制造大量的目标序列。在含有目标序 列的溶液中加入：(1)能够与两侧序列杂交的一对引物，(2)四种脱氧核苷三磷酸，和(3) 热稳定的DNA聚合酶。一轮PCR反应含有三个步骤（图5.7）。 1.链分离。将DNA溶液在95℃加热15S,亲本DNA分子双链分开，成为单链DNA。 2.引物杂交。将DNA溶液迅速冷却至54℃，使引物与DNA链杂交。一种引物与其中一 条DNA链目标序列的3'-端结合，另一种引物与另一条DNA链的3'-末端结合。由于引 物量比亲本DNA多很多，因此不会形成亲本DNA双链。 3.DNA合成。溶液加热至Taq DNA聚合酶最适温度，即72℃。Taq DNA polymerase是从 温泉生长微生物thumus aquaticus分离的。两条引物发生延伸（方向是5'-3")。两条引 物的延伸会超出目标序列。 Flanking sequence Target sequence Add excess primers Heat to separate strands 图5.7第一轮PCR扩增反应。一轮PCR反应含有三个步骤：链分离，引物杂交，和引物延 伸(DNA合成)。 这三个步骤一链分离、引物杂交、和链延伸一构成一轮PC℉扩增。改变混合物的温度 恩能够重复上述操作。DNA聚合酶的热稳定性是PCR反应在一支密闭试管内执行PCR操 作，每轮反应后不必添加试剂。第一轮扩增反应完成后，加热启动第二轮扩增，产生4个双 链。接着启动第三轮扩增（图5.8）。第三轮扩增的产物有两个短链（只含有目标序列和两侧
由于所需产物连接在不溶性支持物上，只是在延伸结束后才从支持物释放出来，因此固 相方法是化学合成 DNA、多肽的理想途径。所有反应都在一个反应器中进行，可以加入过 量试剂驱使化学反应彻底进行。每步反应之后，可以洗去溶剂和副产物。反应结束后，用氨 水处理能够释放合成的寡核苷酸，并除去所有的保护基团。由于延伸反应不能超过 100%， 合成链的长度不一致。最长的寡核苷酸分子就是我们需要的合成产物。合成产物可以用 HPLC 或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。用固相方法曾经合成了长度达到 100 核苷酸的 DNA 链。 能够迅速合成各种序列的 DNA 链使我们能够开展很多研究。例如合成寡核苷酸的末端 用 32P 或荧光基团标记可以用来搜寻很长 DNA 分子或含有很多染色体的基因组中某段互补 的 DNA 序列，用标记寡核苷酸作为探针使用很有效，也很普及。例如，能够与人色体上某 段序列互补的 DNA 探针可以用来探讨染色体上相邻 DNA。用该探针作为引物进行 PCR 扩 增能获得相邻的 DNA 片段。DNA 化学合成技术能够制造新基因。已经有很多实例利用合 成基因表达生产具有新特性的蛋白质。 聚合酶链式反应（PCR）能选择性扩增 DNA 序列 1984 年 Kary Mullis 设计了聚合酶链式反应（PCR）扩增特意的 DNA 序列。DNA 分子 是连续的 DNA 双链。我们所要扩增的 DNA 序列（即目标序列）两侧有非目标 DNA 序列。 如果目标序列两侧的 DNA 序列已知就能用 PCR 扩增制造大量的目标序列。在含有目标序 列的溶液中加入：（1）能够与两侧序列杂交的一对引物，（2）四种脱氧核苷三磷酸，和（3） 热稳定的 DNA 聚合酶。一轮 PCR 反应含有三个步骤（图 5.7）。 1. 链分离。将 DNA 溶液在 95℃加热 15s，亲本 DNA 分子双链分开，成为单链 DNA。 2. 引物杂交。将 DNA 溶液迅速冷却至 54℃，使引物与 DNA 链杂交。一种引物与其中一 条 DNA 链目标序列的 3'-端结合，另一种引物与另一条 DNA 链的 3'-末端结合。由于引 物量比亲本 DNA 多很多，因此不会形成亲本 DNA 双链。 3. DNA 合成。溶液加热至 Taq DNA 聚合酶最适温度，即 72℃。Taq DNA polymerase 是从 温泉生长微生物 thumus aquaticus 分离的。两条引物发生延伸（方向是 5' - 3')。两条引 物的延伸会超出目标序列。 图 5.7 第一轮 PCR 扩增反应。一轮 PCR 反应含有三个步骤：链分离，引物杂交，和引物延 伸（DNA 合成）。 这三个步骤—链分离、引物杂交、和链延伸—构成一轮 PCR 扩增。改变混合物的温度 恩能够重复上述操作。DNA 聚合酶的热稳定性是 PCR 反应在一支密闭试管内执行 PCR 操 作，每轮反应后不必添加试剂。第一轮扩增反应完成后，加热启动第二轮扩增，产生 4 个双 链。接着启动第三轮扩增（图 5.8）。第三轮扩增的产物有两个短链（只含有目标序列和两侧
的引物序列)。后续扩增是目标序列的对数扩增，而更长些的DNA链只能算术扩增，并充 当一些短链（由目标序列和两侧引物序列构成）合成的模板。理想状态下，经过轮PCR 扩增后目标序列的产物是2”倍。经过20轮扩增，目标序列达到数百万倍数量级，30轮能够 达到数十亿数量级。这些扩增可以在1小时内完成。 FIRST CYCLE BEGINS Flanking sequence larget sequence SECOND CCLE RD CYCLE BEGIN Add excess primers Heat to separate Cool Primers UBSEQUENT CYCLES Add heat-stable DNA polymerase Synthesize new DNA rand 兰 。 图5.8多轮PCR反应。第三轮扩增的产物是两分子的短DNA双链（相伴产生的两分子的 长DNA双链没有画出)。短DNA双链就是目标序列。后续的PCR反应能对数扩增目标序 列，而亲本DNA序列只能算术扩增。 这种扩增有几个显著特征值得注意。第一，不必知道目标序列，只需要目标序列两侧的 DNA序列。第二，目标序列比两侧的引物长很多。PCR扩增能够扩增长度超过1Okb的目 标序列。第三，引物与两侧序列并不必要100%配对。用序列已知基因设计的引物，PCR能 够检测基因变异，发现基因家族。第四，提高杂交温度能够提高PCR扩增的严谨性。严谨 性是引物与目标接触（二不是与其它区域接触所需要的）。目标与引物接触受温度、和溶液 盐浓度的影响。温度高，只有两个引物杂交序列之间的DNA才能被扩增。用PCR技术能 够扩增高等生物的某一基因，虽然该基因在总DNA的含量还不到百万分之一。PCR能够扩 增、检测单DNA分子。 PCR是医学诊断、法医和分子进化研究的重要工具 PCR能够提供有价值的医学诊断结果。用特异引物进行PCR能够检测细菌和病毒。例 如，PC能查出没有症状但是已经感染HV的人群（这类人群用抗体免疫检测会漏检）。用 组织培养检测结核杆菌速度慢、劳动量大。用PCR检测，一百万个人细胞中只有10个结核 杆菌就能够检测出来。PC能够坚定一些生长控制基因的（如raS)的基因突变。选择性扩增 特定区域的DNA序列在检测癌症治疗效果方面也有用。如果PC℉检测结果显示癌细胞已 被消除，化疗就可以停止。PCR检测发现停药后癌细胞又出现了，就要恢复用药。PC℉检 测染色体重排导致白血病是非常灵敏准确的。 在法医领域PCR也非常有用。在人群中很多遗传基因是高度可变的，因此这些为，点的 个体DNA谱有个体专一性。例如人白细胞表面抗原(HLA)就是高度可变的，PCR能够确定 个体的HLA类型。若供体和受体的HLA类型不匹配，器官移植后悔产生免疫排斥反应。 多基因PCR扩增还用于亲子鉴定。PCR分析嫌疑人血迹或精液能够找出真正的强奸或杀人 凶犯。犯罪现场留下的一根发根含有足量的DNA进行PCR分型（图5.9）。 DNA分子稳定，尤其是在避光、无水、和隔绝空气的情况下DNA分子就更为稳定。 在这样的条件下，大的DNA分子在几千年的时间内不发生断裂。PCR是扩增古代DNA分 子的理想方法。扩增之后才能进行鉴定和检测。PCR还能扩增那些无法培养微生物的DNA。 下一章将介绍PCR产物的DNA序列能够跟踪不同生物的进化关系
的引物序列）。后续扩增是目标序列的对数扩增，而更长些的 DNA 链只能算术扩增，并充 当一些短链（由目标序列和两侧引物序列构成）合成的模板。理想状态下，经过 n 轮 PCR 扩增后目标序列的产物是 2 n倍。经过 20 轮扩增，目标序列达到数百万倍数量级，30 轮能够 达到数十亿数量级。这些扩增可以在 1 小时内完成。 图 5.8 多轮 PCR 反应。第三轮扩增的产物是两分子的短 DNA 双链（相伴产生的两分子的 长 DNA 双链没有画出）。短 DNA 双链就是目标序列。后续的 PCR 反应能对数扩增目标序 列，而亲本 DNA 序列只能算术扩增。 这种扩增有几个显著特征值得注意。第一，不必知道目标序列，只需要目标序列两侧的 DNA 序列。第二，目标序列比两侧的引物长很多。PCR 扩增能够扩增长度超过 10kb 的目 标序列。第三，引物与两侧序列并不必要 100%配对。用序列已知基因设计的引物，PCR 能 够检测基因变异，发现基因家族。第四，提高杂交温度能够提高 PCR 扩增的严谨性。严谨 性是引物与目标接触（二不是与其它区域接触所需要的）。目标与引物接触受温度、和溶液 盐浓度的影响。温度高，只有两个引物杂交序列之间的 DNA 才能被扩增。用 PCR 技术能 够扩增高等生物的某一基因，虽然该基因在总 DNA 的含量还不到百万分之一。PCR 能够扩 增、检测单 DNA 分子。 PCR 是医学诊断、法医和分子进化研究的重要工具 PCR 能够提供有价值的医学诊断结果。用特异引物进行 PCR 能够检测细菌和病毒。例 如，PCR 能查出没有症状但是已经感染 HIV 的人群（这类人群用抗体免疫检测会漏检）。用 组织培养检测结核杆菌速度慢、劳动量大。用 PCR 检测，一百万个人细胞中只有 10 个结核 杆菌就能够检测出来。PCR 能够坚定一些生长控制基因的（如 ras)的基因突变。选择性扩增 特定区域的 DNA 序列在检测癌症治疗效果方面也有用。如果 PCR 检测结果显示癌细胞已 被消除，化疗就可以停止。PCR 检测发现停药后癌细胞又出现了，就要恢复用药。PCR 检 测染色体重排导致白血病是非常灵敏准确的。 在法医领域 PCR 也非常有用。在人群中很多遗传基因是高度可变的，因此这些为点的 个体 DNA 谱有个体专一性。例如人白细胞表面抗原(HLA)就是高度可变的，PCR 能够确定 个体的 HLA 类型。若供体和受体的 HLA 类型不匹配，器官移植后悔产生免疫排斥反应。 多基因 PCR 扩增还用于亲子鉴定。PCR 分析嫌疑人血迹或精液能够找出真正的强奸或杀人 凶犯。犯罪现场留下的一根发根含有足量的 DNA 进行 PCR 分型（图 5.9）。 DNA 分子稳定，尤其是在避光、无水、和隔绝空气的情况下 DNA 分子就更为稳定。 在这样的条件下，大的 DNA 分子在几千年的时间内不发生断裂。PCR 是扩增古代 DNA 分 子的理想方法。扩增之后才能进行鉴定和检测。PCR 还能扩增那些无法培养微生物的 DNA。 下一章将介绍 PCR 产物的 DNA 序列能够跟踪不同生物的进化关系