简称DNP氨基酸)。该反应由F.Sanger首先发现，并用于鉴定多肽或蛋白质的N.端氨基 酸。除。氢基外，酚羟基、6氨蕃、基也有反应，但反应的产物在酸性条件下，不溶 于乙醚、乙酸乙酯，而留在水相中。 R H-C- COOH N0, C0H. 氢基酸 2,4二硝生氟* DNP.氨基酸 (5)氨基酸与苯异硫氰酸(PITC)的反应在弱碱性条件下，氢基酸与苯异流氰酸反 应生成苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC氢基酸)。在酸性条件下，生成的PTC氨基酸环化而转 变为苯乙内酰硫脲氯基酸，简称PTH-氢基酸。瑞典科学家Edman首先使用该反应测定蛋 白质N末端的氢基酸。 0mg 莱异传氯的 H R 莱氨基货甲酰氯基酸 (6)氨基酸与5'.二甲氮蕃萘l-磺酰氧(S'-dimethyl-.amino-naphthalene-1l-sulfonyl chlo ride,简称DNS-CI)反应产生有荧光的DNS基酸的衍生物。 R-CHCOOH SO,CI SO.NH +HN-H-coH一◇ N(CH) N(CH) DNS-C DNS氨蕃壁 4.a羧基参与的反应 在一定的条件下，氢基酸的。羧基可以和醇成酯。氨基酸可以和碱，如氢氧化钠反应 生成氨基酸的钠盐。当氢基酸转变为相应的氨基酸酯或盐后，其羧基的化学反应性就被掩益 了，而氨基的化学反应性相对地增加，可与一些酰基试剂反应。 5.侧链的反应 (1)米伦(Mon)反应 酪氨酸及含酪氨酸的蛋白质均有此反应，反应产物是红色的 硝酸汞、亚硝酸汞等的混合物。 (2)福林(Foi)反应福林试剂的主要成分是磷酸和碘钨酸。在碱性条件下，酪 氨酸及含酪氨酸的蛋白质和福林试剂反应产生一种蓝色的化合物。 (3)坂口反应(Sakoguchi reaction)是精氨酸特有的反应。试剂的主要成分是碱性次 澳酸钠、a萘酚：精氨酸可与之反应产生红色的产物。 (④)Pay反应试剂的主要成分为：5%的对氨基苯磺酸盐酸溶液，亚硝酸钠，碳酸 钠：组氨酸、酪氨酸与该试剂在0一4℃反应，生成橘红色的产物。 12
(5)乙醛酸(glyoxalate)反应这是色氨酸特有的反应，色氨酸与乙醛酸和浓硫酸反 应，在溶液的界面处产生一种紫红色的物质。 (6)半胱氨酸的反应半胱氨酸可与亚硝酸.铁氰化钠的甲醉溶液反应产生一种红色的 化合物。 第三节蛋白质的结构 自然界存在的蛋白质大约有10一102种，不同的蛋白质具有不同的结构，那么，由 20种氮基酸如何组成了数目繁多、结构各异的蛋白质大分子？20世纪50年代初，Linder- stron-Log及其同事最先认识到蛋白质具有不同的结构层次，并引人一级、二级、三级结构 来描述这一现象。这是蛋白质分子在结构上的一个最显著的特征。这种划分尽管有一定的缺 点，但它反映了蛋白质分于结构的多层次和错综复杂的基本特点。这种划分概念清楚，使用 也方便。60年代以后，随着对蛋白质分子结构知识的积，又增加了不少新的内容。如在 三级结构以上又增加了四级结构，在二级和三级结构之同又增加了超二级结构和结构域这两 个结构层次。 天然蛋白质都具有独特而稳定的三维结构，即构象(conformation)。构象是指分子内 各原子或基团之间的相互立体关系。构象的改变是由于单键的旋转而产生的，不需有共价键 的变化（断裂或形成），但涉及到氢键等次级键的改变。1969年国际纯化学和应用化学联合 会(IUPAC)规定在描述蛋白质等生物大分子的空间结构时应使用构象一词。按照这种划 分二级结构以上的结构都属于构象的范畴。构型(configuration),是指在立体异构体中 取代基团或原子因受某种因素的限制，在空间取不同位置所形成的不同立体结构。如儿何 (顺反)异构体中，取代基团因受双键的限制，面有顺式和反式两种构型：在光学异构体中， 碳原子上的四个基团不同，只可能取两种不同的空间排布，这两种不同的空间排布称为不 司的构型。构型的改变必须有共价罐的新裂 ，置白质的一级结构 蛋白质的一级结构(primary structure)又称为共价结构、化学结构。不同的蛋白质都 具有特定的构象，但从一级结构来看，蛋白质是由许多的氨基酸按照一定的排列顺序，通过 肽键相互连接起来的多肽链结构。1969年，UPAC曾规定蛋白质的一级结构是指肽链中的 氨基酸排列顺序和连接方式。它是蛋白质分子结构的基础，包含了决定蛋白质分子所有结构 层次构象的全部信息。 1.肽键和肚链 1902年，Hofmeister和Fischer各自提出了肽键(peptide bond)是蛋白质中氢基酸之 间的主要连接方式，即一个氨基酸的。基与另一个氨基酸的。氨基之间脱去一分子水相 互连接（图13）。 因13一个五肽的结构 13
蛋白质结构的肽键学说的正确性，已被许多研究者所证实。1888年，俄国科学家发现】 双缩家在碱性条件下，与硫酸铜反应可生成一种粉红色的化合物，而天然蛋白质也有此反 应。推测蛋白质分子中可能存在类似于双缩脲的结构。酸碱满定的结果说明，蛋白质分子中 含有的自由氨基和梭基较少，在蛋白质的水解过程中，随着水解的进行，商定值逐渐增加 说明氨基酸分子中的氨基和羧基在构成蛋白质大分子时，参与了某种结合。1902年 E.Fischer人工合成了18肽，合成的18肽能被蛋白水解酶水解，且呈现双缩脲反应。已知 蛋白专一性水解肽键，这就进一步确证了蛋白质分子中的氢基酸之间是通过肽健相互连 接的。 一个氨基酸的。一羧基与另一个氨基酸的。氨基之间失去一分子水相互连接而成的 化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由三个氨基酸组成的肽可以称为三 肽。由5个氯基酸组成的一个五肽的结构如图13所示。一般把小于10个氨基酸组成 的肽称为寡肽，而大于0个氨基酸组成的肽称为聚肽或多肽。因此蛋白质的一级结构 就是多肽链结构 在某些肚中，有非a羧基和a氨基之间形成的肽键。如谷胱甘肽分子中，谷氨酸的y 羧禁和半酰氨酸的α氨基之间形成肽键。这样的肽键很稳定，不易被蛋白酶作用。 COOH CH CO-NH-CH-CO-NH-CH:COOH CH SH 谷胱甘肽的分子结构 肽链结构中有主链和侧链之分。主链骨架是指除侧链R以外的部分：肽链中的每一个 氨基酸，由于相互连接失去一分子水，与原来的相比，分子稍有残缺，因此通常把肽链中的 每一个氨基酸单位称为氨基酸残基。任何一个肽， 尽管它的氨基和羧基相互连接成肽键 在肽链的一端仍有自由的氨氢基，另一端仍有自由的骏基，分别称为氢基末端（或N端）和 羧基末端（或C端）。 2.肽的命名及结构 一个肽可根据所含的氨基酸残基数简单地称为二肽、三肽和四肽。但肽的命名一般是根 据其功能和来源。如脑啡肽(enkephalin,EK)；1975年，Hughes and kosterlitz发现猪脑 内有内源性吗啡样活性物质，并从脑抽提液中分离纯化出两种脑啡肽，均由了个氨基酸组 成。残已证明，高等动物脑中有两种形式的脑啡肽： 蛋氨酸脑啡肽，H一Tyr.Gly.Gly-Phe-Met-OH 亮氨酸脑啡肽，H-一Tyr-Gy-Gly-Phe-Leu一OH 它们都有镇痛作用，因面又称为镇痛肚(anodynin)。对他们的深入研究，不仅有可能 人工合成出一类既具有镇痛作用，而又不像吗啡那样使人上葱的药物来 自然界中存在的肽有开链式结构和环状结构。对环状肽，找不到它的自由的氨基端和自 由的羧基端。环状肽在微生物中常见。如短杆菌肽S(图【4)，对革兰氏阳性细菌有强大的 抑制作用。a-鹅青簟碱，是一个环状8肽，存在于毒蘑菇中，它能抑制真核RNA聚合膜的 14
活性，从而抑制核糖核酸(RNA)的合成，导致机体死 亡。Y谷氨酰酞与氨基酸的运输有关，是氨基酸的载体。 肌肽(carnosine)和鹅肌肽(anserine),存在于肌肉、骨 酪肌中 可能参与肌肉的收缩。 L-Val 大多数小肽具有一定的结品形状，熔点较高，有自 己的等申点。含两个或两个以上肚键的化合物都有双缩 L-Pro 暴反应：因此，除二肽外，肽都有双缩脲反应。 3,肽链表达式 D-phe L-Om 肽是由氨基酸相互之间满过肽键形成的化合物。若 用结构式表示，占空间较大，且不方便 般小贴常用 对多肽，一般用氨基酸中文名称的字头表示，中间用 围14短杆蓝就S的结构 “.”号或“”号将它们隔开，也可用氮基酸英文名称的三字符或单字符缩写表示，中问用 “.”号或“”号将其隔开 甘·丙·丝+缬·亮·蛋·赖·赖·精·谷. Gly-Ala-Ser-Val-Leu-Met-Lys-Lys-Arg-Glu. G-A-S-V-L-M-K-K-R-E 20种常见的氨基酸的三字符或单字符缩写见图11和图12所示。在书写时，含自由氨 基的一端总是写在左边，含自由搬基的那端总是写在右边。有些肽的氨基端是乙酰化的，如 细胞色素C氨基端的甘氨酸是乙酰甘氨酸有些肽的羧基端是酯化的或酰胺化的，如催产 素羧基端的甘氢酸为酰胺化的甘氨酸，也应写出。如 Cys-Ty:-le-Gl-Aan-Cys-Pro-LGNH. 牛催产素的结构 4.一级结构研究 一级结构研究包括蛋白质的氨基酸组成，氢基酸排列顺序和二硫键位置，肽链数目，末 端氨基酸的种类等。 在生物化学及其相关的领域中，许多问题都需要知道蛋白质的一级结构。蛋白质顺序分 析是揭示生命的本质，明结构与功能的关系，研究藤的活性中心和酶蛋白高级结构的基 础，也是研究基因表达、克隆和核酸顺序分析的重要内容。一且摘清了某种蛋白质的一级结 构，就为人工合成这种蛋白质创造了条件。多肽链中氨基酸排列顺序测定的开拓者是英国著 名的生物化学家桑格(S.Sanger)),他用了十年的时间，于1953年首次报道了胰岛素的全部 氢基酸排列顺序，从面揭开了蛋白质一缓结构研究的序幕。在20世纪40年代 级结构研 究被认为是无从入手的大难题，组成蛋白质的氨基酸只有20种，而一觳蛋白质中都含有上 百个氨基酸，如何确定它们之间的排列顺序？桑格选择了随岛素，胰岛素分子虽小，但具有 代表性。目前蛋白质顺序分析工作尽管其测定方法有了改进，顺序测定的自动化程度也有了 很大的提高，但基本的方法是相同的。一级结构测定的基本方法有如下几种。 1)获取一定量的纯的蛋白质样品，且分子量已知 将一部分样品完全水解，确定该种 蛋白质中的氨基酸种类、数目和每种氨基酸的含量。 2)进行末缆分析确定该种蛋白质的肽链数目，N端和C端各是什么氨基酸。 ①N末端分析
a.2,4二硝基氟苯(FDNB)法。在弱碱性(pH8-9)条件下，多肽链N端的氨基酸 与FDNB试剂反应生成一种二硝基苯肽(DNP肽)。后者经酸水解，可得到黄色的二硝基 苯氨基酸(DNP.氨基酸)和其他氨基酸的混合液「图15(a)1。其中只有DNP.氨基酸溶于 乙酸乙酯：故用乙酸乙酯抽提将抽提液进行色谱分析，并用标准的DNP氢基酸作为对照可 鉴定之。除氨基末端的氨基酸反应外，侧链氨基也可有此反应，但反应较慢，且生成的 DNP氨基酸不溶于乙酸乙酯，而保留在水相。 b.Edman降解法。这是瑞典科学家P.Edman建立的。蛋白质多肽链N荣的氮基酸与 苯异碗氰酸酯在弱碱性条件下反应生成苯氨基硫甲酰肽(phenylthiocarbamyl peptide,简称 PTC-肽)。在酸性条件下后者环化生成苯乙内酰硫脲氨基酸(PTH氨基酸)及N端少了一 个氨基酸的肽链[图15(b)门。在酸性条件下，生成的PTH氨基酸极稳定，用乙酸乙酯抽 提，PTH氢基酸溶于乙酸乙酯，经高压液相层析鉴定可知N端是什么氨基酸。该法优点， 可违续分析出N端的十几个氨基酸。自动顺序分析仪就是根据该反应原理而设计的。 0 ON〈〉F+N-CCGh一AspPhe-ArGyC CH, pH8-9 Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-C NO:CH NO: 0 Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-C CH 0 州8-9 0 b Gly-Asp-Phe-Ag一Cy CH. 0 N-Gly-Am 函15N末分析法 ()2,+二硝蕃张苯法：《6》Edmn年解击 c.5-二甲氨基萘-l-磺酰氯法（丹磺酰氯法，DNS法）。1963年，Giray and Hartley发 现，5二甲氨基券】磺酰氯，简称丹磺酰氧，可与多肽饶N端的氨基酸的氨蕃反应，生成 丹磺酰肽(DNS-肽)，后者经酸水解产生DNS氨基酸（具有荧光）和其他游高的氨基酸 (图1-6)。用乙酸乙酯抽提，可得到DNS-AA,用色谱分析可鉴定之。该法灵敏度很高。 16