2.计算待测样品浓度根据图中数值，计算出待测样品的浓度。六、实验注意事项（一）实验操作注意事项1.Folin-酚乙试剂在碱性条件下不稳定，当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前：2.尽量减少各管之间的反应时间误差；3.一定要注意实验的时间，因为溶液的光密度值是随着时间在不断增大的，如果时间超过了30分钟，则测得的光密度值就不准确了；4.在使用分光光度计时，拿比色血是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面，防止自己手上的油污是测量值不准确5.在擦拭比色血时，要顺着一个方向擦；6.在比色血中装入的液体量大约要是比色皿体积的三分之二（二）标准曲线制作注意事项1.作一条标准曲线至少要5个点2.被测物与标准物应在相同条件下测定3.尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧4.标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使标准曲线范围在被测物质浓度的1/2～2倍之间，并使吸光度在0.05～1.0范围为宜（三）移液枪使用注意事项1.量程选择：35%-100%范围内最佳2.大体积一小体积顺时针：小体积一→大体积逆时针3将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可4.吸液：垂直吸液，枪头尖端需浸入液面2-4mm以下。慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度。吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。5.放液：将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40°倾斜。平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟后压到二档，排出剩余液体。压住按钮，同时提起移液枪，松开按钮。按弹射器除去移液嘴。6.使用完毕：至最大量程，让弹簧恢复原形，挂至移液枪架上
2. 计算待测样品浓度 根据图中数值，计算出待测样品的浓度。 六、实验注意事项 （一）实验操作注意事项 1. Folin-酚乙试剂在碱性条件下不稳定，当 Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶 液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨 酸试剂被破坏之前; 2. 尽量减少各管之间的反应时间误差； 3. 一定要注意实验的时间，因为溶液的光密度值是随着时间在不断增大的，如 果时间超过了 30 分钟，则测得的光密度值就不准确了； 4. 在使用分光光度计时，拿比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑 面，防止自己手上的油污是测量值不准确； 5. 在擦拭比色皿时，要顺着一个方向擦； 6. 在比色皿中装入的液体量大约要是比色皿体积的三分之二. （二）标准曲线制作注意事项 1. 作一条标准曲线至少要 5 个点 2. 被测物与标准物应在相同条件下测定 3. 尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧 4. 标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使标准曲线范围在被测物质浓 度的 1/2～2 倍之间，并使吸光度在 0.05～1.0 范围为宜 （三）移液枪使用注意事项 1. 量程选择：35%-100%范围内最佳 2. 大体积→小体积 顺时针; 小体积→大体积 逆时针 3. 将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可 4. 吸液: 垂直吸液，枪头尖端需浸入液面 2-4mm 以下。慢吸慢放，控制好弹 簧的伸缩速度。吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。 5. 放液: 将吸嘴口贴到容器内壁并保持 10-40°倾斜。平稳地把按钮压到一档， 停约一秒钟后压到二档，排出剩余液体。压住按钮，同时提起移液枪;松开 按钮。 按弹射器除去移液嘴。 6. 使用完毕: 至最大量程, 让弹簧恢复原形，挂至移液枪架上
七、思考题1.试述Folin-酚试剂法的优点？2.应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？3.什么叫标准曲线？绘制标准曲线有何实用意义？实验二蛋白质浓度测定（2）-紫外线（UV）吸收法一、实验目的1.学习紫外线（UV）吸收法测定蛋白质含量的原理2.了解紫外分光光度计的构造原理3.掌握它的使用方法。二、实验原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。三、实验试剂及仪器1.实验试剂（1）标准蛋白质溶液（1mg/ml）（2）待测蛋白质溶液，浓度需稀释至1mg/ml附近。2.实验仪器紫外分光光度计、微量移液器、枪头、试管和试管架等四、实验步骤1.标准曲线法：取8支试管，按下表加入试剂（单位ml），并进行操作，绘制标准曲线
七、思考题 1. 试述 Folin-酚试剂法的优点？ 2. 应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？ 3. 什么叫标准曲线？ 绘制标准曲线有何实用意义？ 实验二 蛋白质浓度测定(2)-紫外线（UV）吸收法 一、实验目的 1. 学习紫外线（UV）吸收法测定蛋白质含量的原理 2. 了解紫外分光光度计的构造原理 3. 掌握它的使用方法。 二、实验原理 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具 有吸收紫外线的性质，吸收高峰在 280nm 波长处。在此波长范围内，蛋白质溶 液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓 度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中） 广泛应用。 此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差 异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的 物质，会出现较大的干扰。 不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即 使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。 三、实验试剂及仪器 1. 实验试剂 （1）标准蛋白质溶液（1mg/ml） （2）待测蛋白质溶液，浓度需稀释至 1mg/ml 附近。 2. 实验仪器 紫外分光光度计、微量移液器、枪头、试管和试管架等 四、实验步骤 1. 标准曲线法： 取 8 支试管，按下表加入试剂（单位 ml），并进行操作，绘制标准曲线
A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标（蛋白质浓度为mg/ml)。243a50管号1440607e840.53. 0标准蛋白质溶液。p0.0m1.01.52.54.04样液2.0蒸馏水4.003.5k3.02.52. 01.51. 00.00Oe?4蛋白质浓度0.1250.2500.3750.6250.7501. 004K44t4Aarirt2.取待测蛋白质溶液2.0ml于5号试管中，加入蒸馏水2.0ml，摇匀，按上述方法测定A280，在标准曲线上查出待测蛋白质浓度。五、实验结果与分析1.原始数据：记录各管的OD值2.绘制出标准曲线：要求规范作图（1）用铅笔作图、（2）标出横、纵坐标名称及单位（3）标出日期、作者、曲线名称（4）曲线上体现出待测样品的OD值及浓度值。3.计算：蛋白质含量。（1）要求：写出公式、代入数据、写出结果。(2）根据标准曲线R2值判断实验结果是否可靠，分析可能造成实验误差的原因有哪些？六、实验注意事项1.比色血使用时注意不要沾污或将比色血的透光面磨损，应手持比色血的毛面。2.待测液制备好后应尽快测量，避免有色物质分解，影响测量结果。3.测得的吸光度A最好控制在0.2~0.8之间，超过1.0时要做适当稀释。4.开关试样室盖时动作要轻缓。5.不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器。6.比色血在盛装样品前，应用所盛装样品冲洗两次，测量结束后比色皿应用蒸馏水清洗干净后倒置晾干。若比色皿内有颜色挂壁，可用无水乙醇浸泡清洗。七、思考题1.紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？
A280 值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标（蛋白质浓度为 mg/ml）。 2. 取待测蛋白质溶液 2.0 ml 于 5 号试管中,加入蒸馏水 2.0 ml，摇匀，按上述方 法测定 A280，在标准曲线上查出待测蛋白质浓度。 五、实验结果与分析 1． 原始数据:记录各管的 OD 值 2． 绘制出标准曲线：要求规范作图 （1）用铅笔作图、 （2）标出横、纵坐标名称及单位 （3）标出日期、作者 、曲线名称 （4）曲线上体现出待测样品的 OD 值及浓度值。 3. 计算：蛋白质含量。 （1）要求： 写出公式、代入数据、写出结果。 (2）根据标准曲线 R 2 值判断实验结果是否可靠，分析可能造成实验误差 的原因有哪些？ 六、实验注意事项 1. 比色皿使用时注意不要沾污或将比色皿的透光面磨损，应手持比色皿的毛 面。 2. 待测液制备好后应尽快测量，避免有色物质分解，影响测量结果。 3. 测得的吸光度 A 最好控制在 0.2~0.8 之间，超过 1.0 时要做适当稀释。 4. 开关试样室盖时动作要轻缓。 5. 不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器。 6. 比色皿在盛装样品前，应用所盛装样品冲洗两次，测量结束后比色皿应用 蒸馏水清洗干净后倒置晾干。若比色皿内有颜色挂壁，可用无水乙醇浸泡 清洗。 七、思考题 1. 紫外吸收法与 Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？
2.若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？3.分析实验误差产生的原因4.为什么吸光度A最好控制在0.2~0.8之间？实验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳一、实验目的1.了解电泳的一般原理2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术3.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法二、实验原理血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。血清中含有清蛋白，α-球蛋白、β-球蛋白、Y-球蛋白和各种脂蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同，因此可以将它们分离。在相同碱性PH值缓冲体系中，分子量小、等电点低、带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度较快。醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的一种电泳方法。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120um，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支持物。具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和保存等优点。常用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血浆蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。三、实验试剂及仪器1.实验试剂、材料巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液，染色液，漂洗液，血清：医院采血2.实验仪器常压电泳仪、水平电泳槽、点样器、滤纸、醋酸纤维素薄膜、培养血、镊子等四、实验步骤1.准备和点样：将醋酸纤维素薄膜（2cmX8cm）浸入缓冲溶液中，待完全浸透用镊子轻轻
2. 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？ 3. 分析实验误差产生的原因 4. 为什么吸光度 A 最好控制在 0.2~0.8 之间？ 实验三 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 一、实验目的 1. 了解电泳的一般原理 2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术 3. 掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法 二、实验原理 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于 pH7.4。它们在 pH8.6 的缓冲 液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。 血清中含有清蛋白，α -球蛋白、 β -球蛋白、γ -球蛋白和各种脂蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构 象、分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速 度也不同，因此可以将它们分离。 在相同碱性 PH 值缓冲体系中， 分子量小、 等电点低、带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度较快。 醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的一种电泳方法。 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，该膜具有均一的泡 沫状结构，厚度约为 120μ m，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的 电泳支持物。具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和保存 等优点。常用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血浆蛋白、血红蛋白、 球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。 三、实验试剂及仪器 1. 实验试剂、材料 巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液，染色液，漂洗液，血清:医院采血 2. 实验仪器 常压电泳仪、水平电泳槽、点样器、滤纸、醋酸纤维素薄膜、培养皿、镊子等 四、实验步骤 1. 准备和点样 ： 将醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）浸入缓冲溶液中，待完全浸透用镊子轻轻
取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后将无光泽面朝上平放于滤纸上。点样器在血清上蘸一下，再将点样器轻印在加样线上，使血清成一条状点于醋酸纤维素薄膜一端1.5厘米处，将薄膜无光泽面朝下，点样端为阴极，进行电泳。8cm个点样线(粗面）2cm点样区+1.5cm2.电泳条件：电压80-90V，恒压，1h，电流与薄膜多少相关。3.染色、漂洗：电泳完毕，将薄膜浸于染色液中10分钟，取出，置漂洗液中漂洗2-3次至背景无色，再浸于蒸馏水中观察。五、实验结果与分析以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、α2-、β-及Y-球蛋白，如下图所示。电泳方向+Aα2α1βy血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱对照各自电泳结果，分析各将条带是否成功分离，存在的问题及原因有哪些？六、实验注意事项1.薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2.应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。3.分清薄膜的点样面，点样应点在薄膜的毛面上。4．点样要细窄、均匀、集中；点样量要适量，不宜过多或过少；动作要轻、稳，用力不能太大
取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后将无光泽面朝上平放于滤纸 上。点样器在血清上蘸一下，再将点样器轻印在加样线上，使血清成一条状点 于醋酸纤维素薄膜一端 1.5 厘米处，将薄膜无光泽面朝下，点样端为阴极，进 行电泳。 2. 电泳条件： 电压 80-90V，恒压，1h，电流与薄膜多少相关。 3. 染色、漂洗： 电泳完毕，将薄膜浸于染色液中 10 分钟，取出，置漂洗液中漂洗 2-3 次至 背景无色，再浸于蒸馏水中观察。 五、实验结果与分析 以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在 PH8.6 的缓冲体系中电泳 1h 左 右，染色后可显示 5 条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α 1-、α 2-、β -及 γ -球蛋白，如下图所示。 对照各自电泳结果，分析各将条带是否成功分离，存在的问题及原因有哪些？ 六、实验注意事项 1 .薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2. 应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 3. 分清薄膜的点样面，点样应点在薄膜的毛面上。 4. 点样要细窄、均匀、集中；点样量要适量，不宜过多或过少； 动作要轻、 稳，用力不能太大