9.脱色液：酒精：冰醋酸：水=7.5：7.5：853.实验步骤1.装配做胶用的玻璃板"三明治"：做1.0mm厚的胶。选择两侧的玻璃夹条为1mm的玻璃板，将其夹条面朝上平放在桌面上，把灰色的U形硅胶夹条在上面摆好，然后把带两个“耳朵”的凹玻璃放在上面，使U形硅胶夹条平整、服帖地夹在两块玻璃板之间。小心地把这玻璃板“三明治”放到“提篮架子”上，用塑料的“楔子”夹紧，注意底部的U形硅胶夹条在夹紧的过程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夹缝加满蒸馏水，检验是否漏，如果漏水必须重装。2.配制浓度为12%的分离胶（凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择），配方如下:双蒸水3.3 mL1.5mo1/LTris·HCIpH8.8)2.5 mL4.0 mLAcr / Big(30%)10% SDS100μLTEMED10μL10%AP100 μL总体积10mL（刚好灌制两块胶）混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水（在胶面上加蒸馏水称水封，目的是保持胶面平整，并防止胶与空气接触，影响胶的聚合），室温放置，等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），将水封倾去。这时可以开始配制4%的浓缩胶，配方如下：双蒸水1.8mL0.75mL0.5mo1/LTris·HCIpH6.80.4 mLAcr / Bis (30%)10% SDS30 μLTEMED5μL10%Ap30μL总体积3.0mL（够做两块板的浓缩胶）混匀后加入到"三明治"玻璃板的夹缝中，然后在把1mm的梳子插进浓缩胶中，注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。如果发现有较大的气泡，一定要想法去掉（可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等），否则会影响电泳结果。待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理，使之齐整。3，细菌培养物SDS-PAGE样品的制作：同时做L-阿拉伯糖诱导的和未加L-阿拉伯糖的两个大肠杆菌样。取细菌培养物1.5mL加到1.5mL小离心管中，12000r/m离心3分钟，去上清。在离心沉淀中加约等体积的蒸馏水，用枪头小心地吹打，使细菌充分悬浮，直到没有明显的小团块，然后加入等体积的2×样品缓冲液，在100℃沸水浴（或干式培养器）中保温5min。此时如用枪头吸取样品，会发现非常粘稠，呈鼻涕状，这是因为有样品中含有大量DNA的结果。要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出，反复多次才能将DNA分子打断，使样品变得不再粘稠为止。将样品14000r/m离心5分钟，使不溶物沉淀下来，小心吸取上清加样。电泳样品的处理直接关系到电泳结果的好坏，一定要认真做样，否则跑不出好胶来。4.琼脂封底：做好胶后，把玻璃板“三明治”从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶11
11 9．脱色液： 酒精：冰醋酸：水＝7.5：7.5：85 3． 实验步骤 1．装配做胶用的玻璃板"三明治"：做 1.0mm 厚的胶。选择两侧的玻璃夹条为 1mm 的玻 璃板，将其夹条面朝上平放在桌面上，把灰色的 U 形硅胶夹条在上面摆好，然后把 带两个“耳朵”的凹玻璃放在上面，使 U 形硅胶夹条平整、服帖地夹在两块玻璃板 之间。小心地把这玻璃板“三明治”放到“提篮架子”上，用塑料的“楔子”夹紧， 注意底部的 U 形硅胶夹条在夹紧的过程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治” 的夹缝加满蒸馏水，检验是否漏，如果漏水必须重装。 2．配制浓度为 12％的分离胶 (凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择)，配方如 下： 双蒸水 3.3 mL 1.5mo1／L Tris·HCl (pH 8.8) 2.5 mL Acr／Big(30％) 4.0 mL 10％ SDS 100 µL TEMED 10 µL 10％AP 100 µL 总体积 10 mL （刚好灌制两块胶） 混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入 1cm 蒸馏水(在胶面上加蒸馏水 称水封，目的是保持胶面平整，并防止胶与空气接触，影响胶的聚合)，室温放置， 等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），将水封倾去。这时可以 开始配制 4％的浓缩胶，配方如下： 双蒸水 1.8 mL 0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 0.75mL Acr／Bis (30％) 0.4 mL 10％ SDS 30 µL TEMED 5µL 10％Ap 30µL 总体积 3.0 mL （够做两块板的浓缩胶） 混匀后加入到"三明治"玻璃板的夹缝中，然后在把 1mm 的梳子插进浓缩胶中， 注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。如果发现有较大的气泡，一定要想法去掉 （可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等），否则会影响电泳结果。待浓缩胶凝固后， 小心拔出梳子。如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器 的针头小心加以整理，使之齐整。 3．细菌培养物 SDS-PAGE 样品的制作：同时做 L-阿拉伯糖诱导的和未加 L-阿拉伯糖的 两个大肠杆菌样。取细菌培养物 1.5mL 加到 1.5mL 小离心管中，12000r/m 离心 3 分 钟，去上清。在离心沉淀中加约等体积的蒸馏水，用枪头小心地吹打，使细菌充分 悬浮，直到没有明显的小团块，然后加入等体积的 2×样品缓冲液，在 100℃沸水浴 (或干式培养器)中保温 5min。此时如用枪头吸取样品，会发现非常粘稠，呈鼻涕状， 这是因为有样品中含有大量 DNA 的结果。要用胰岛素注射器将样品从极细的针头 中打出，反复多次才能将 DNA 分子打断，使样品变得不再粘稠为止。将样品 14000r/m 离心 5 分钟，使不溶物沉淀下来，小心吸取上清加样。电泳样品的处理直接关系到 电泳结果的好坏，一定要认真做样，否则跑不出好胶来。 4．琼脂封底：做好胶后，把玻璃板“三明治”从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶
夹条去掉。去掉夹条后在凝胶的底部会留下一空隙，此空隙要用2%融化的琼脂填满，否则在玻璃板浸到电极缓冲液后空隙中的空气将很难彻底排除掉，电泳时会明显影响导电，严重时会使整个电泳失败。琼脂封底时注意不要产生气泡。5.电泳槽组装：封底后将玻璃板“三明治”凹玻璃面向内重新装到“提篮架子”上固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。加液时要使内外槽中的液面基本等高，内槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm，以保证能够导电，且电场均匀。6.加样：按事先设计好的顺序与加样量依次加样。在样品的浓度未知的情况下，同一样品可加一梯度，即每一泳道的加样量依次减半。这样，在做第二次电泳时可以其作为参考，正确加样。蛋白分子量标准可以加在靠中间的加样孔中，也可加在离边的第2道处（最靠边的一道样品往往会明显跑斜）。7.电泳：将电泳槽的盖子盖上，把电泳槽的两个电极接到电泳仪上（注意电极不要接错），然后接通电源。先将电压调到80V，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，关掉电源，停止电泳。将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，暴露出胶面。将浓缩胶部分去掉不要，分离胶放到塑料盒中染色。8.染色和脱色：凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色20分钟（摇床上缓慢振荡），然后倾去染色液（染色液回收，可反复用数十次），用自来水洗几下，去掉凝胶上和塑料盒中的染色残液，加脱色液脱色（摇床上缓慢振荡），1小时后换一次脱色液，振荡脱色过夜。彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰，背景透明干净。这时可以将凝胶拍照或用扫描仪进行扫描，作为永久记录。5.实验结果染色后的聚丙烯酰胺凝胶上可见许多大大小小的条带。比较两个大肠杆菌样品，经阿拉伯糖诱导的与未加阿拉伯糖诱导的，前者在约25kD处明显多一条带，这就是GFP所在的位置。12
12 夹条去掉。去掉夹条后在凝胶的底部会留下一空隙，此空隙要用 2%融化的琼脂填满， 否则在玻璃板浸到电极缓冲液后空隙中的空气将很难彻底排除掉，电泳时会明显影 响导电，严重时会使整个电泳失败。琼脂封底时注意不要产生气泡。 5．电泳槽组装：封底后将玻璃板“三明治”凹玻璃面向内重新装到“提篮架子”上， 固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。加液时要使内外 槽中的液面基本等高，内槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少 5mm， 以保证能够导电，且电场均匀。 6．加样：按事先设计好的顺序与加样量依次加样。在样品的浓度未知的情况下，同一 样品可加一梯度，即每一泳道的加样量依次减半。这样，在做第二次电泳时可以其 作为参考，正确加样。蛋白分子量标准可以加在靠中间的加样孔中，也可加在离边 的第 2 道处（最靠边的一道样品往往会明显跑斜）。 7．电泳：将电泳槽的盖子盖上，把电泳槽的两个电极接到电泳仪上（注意电极不要接 错），然后接通电源。先将电压调到 80V，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在 150V。当溴酚蓝移动到离底部约 0.5cm 时，关掉电源，停止电泳。将玻璃板从电泳 槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，暴露出胶面。将浓缩胶部分去掉不 要，分离胶放到塑料盒中染色。 8．染色和脱色：凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色 20 分钟（摇床上缓慢振荡），然后倾 去染色液（染色液回收，可反复用数十次），用自来水洗几下，去掉凝胶上和塑料盒 中的染色残液，加脱色液脱色（摇床上缓慢振荡），1 小时后换一次脱色液，振荡脱 色过夜。彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰，背景透明干净。这时可以将凝胶拍照或 用扫描仪进行扫描，作为永久记录。 5. 实验结果 染色后的聚丙烯酰胺凝胶上可见许多大大小小的条带。比较两个大肠杆菌样品，经阿 拉伯糖诱导的与未加阿拉伯糖诱导的，前者在约 25kD 处明显多一条带，这就是 GFP 所在 的位置
实验四PCR扩增DNA片段及扩增产物的检测分析1.实验原理PCR(PolymeraseChainReaction)为聚合酶链反应，或体外扩增技术。PCR的原理类似于天然DNA的复制，主要利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物之间引发聚合酶反应。PCR全过程基于一套“三步曲”：（1)DNA模板的变性，在95℃高温附近，模板DNA双链变性形成单链DNA而游离于反应溶液中；(2)与附加引物退火，在降温过程中，加入反应体系中的两种引物将退火至相应互补的DNA链上；（3)引物延伸（扩增步骤），将反应体系调节到所选用的DNA聚合酶的最适温度（72℃左右），在4种dNTP存在下，DNA聚合酶延着引物和模板复合物，由5”→3端延伸，而新合成的引物延伸链则可作为下一轮反应的模板。以上“三步曲”即构成一个循环，如此重复进行，每循环一次，DNA分予数即按指数倍增(2n)，若循环次数n=25，DNA即已比原来扩增了百万倍。PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主要用来检测小片段DNA。2.试剂及器材1.DNA扩增仪2.20ul，200ul微量加样器3.电泳仪、电泳槽4.紫外透射分析仪5.10XPCR缓冲液：0.1mol/LTris-CI(pH8.3)，0.5mol/IKCl,15mmol/1Mgcl20.1%明胶6.引物：上游引物：下游引物：7.1.25mmol /1dNTP8.50%甘油9.TaqDNA聚合酶(lu/ul)3．实验操作1）PCR反应体系的建立。按顺序在0.5ml塑料小试管中加入以下试剂10XPCR缓冲液2.5uldNTP 4ul引物各lul待测样品（鼠肝DNA）3.OulH205.0甘油5.0TaqE lul在震荡器上将各组份充分混匀，短暂离心后加一滴液体石蜡覆盖于液体表面。13
13 实验四 PCR 扩增 DNA 片段及扩增产物的检测分析 1. 实验原理 PCR(PolymeraseChainReaction)为聚合酶链反应，或体外扩增技术。PCR 的原理类似于 天然DNA 的复制，主要利用DNA 聚合酶依赖于DNA 模板的特性，模仿体内的复制过程， 在附加的一对引物之间引发聚合酶反应。 PCR 全过程基于一套“三步曲”：(1)DNA 模板的变性，在95℃高温附近，模板DNA 双 链变性形成单链DNA 而游离于反应溶液中；(2)与附加引物退火，在降温过程中，加入反应 体系中的两种引物将退火至相应互补的DNA 链上；(3)引物延伸(扩增步骤)，将反应体系调 节到所选用的DNA 聚合酶的最适温度(72℃左右)，在4 种dNTP 存在下，DNA 聚合酶延着 引物和模板复合物，由5’→3’端延伸，而新合成的引物延伸链则可作为下一轮反应的模板。 以上“三步曲”即构成一个循环，如此重复进行，每循环一次，DNA 分予数即按指数倍增 (2n)，若循环次数n=25，DNA 即已比原来扩增了百万倍。 PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确可靠的预 期特定扩增产物。凝胶电泳是检测 PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助 于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA 片段大于 100bp者，后者主要用来检测小片段DNA。 2. 试剂及器材 1．DNA 扩增仪 2．20ul，200ul 微量加样器 3．电泳仪、电泳槽 4. 紫外透射分析仪 5．10XPCR 缓冲液：0．1mol／L Tris-Cl (pH8．3)，0．5mol/l KCl, 15mmol／1 Mgcl2 0.1％ 明胶 6．引物：上游引物： 下游引物： 7．1.25mmol／l dNTP 8．50％甘油 9．TaqDNA 聚合酶(1u／ul) 3. 实验操作 1）PCR 反应体系的建立。 按顺序在0．5ml 塑料小试管中加入以下试剂： 10XPCR 缓冲液 2．5ul dNTP 4ul 引物 各lul 待测样品(鼠肝DNA) 3．0ul H20 5.0 甘油 5.0 TaqE lul 在震荡器上将各组份充分混匀，短暂离心后加一滴液体石蜡覆盖于液体表面
2）扩增将加好样的试管置于DNA扩增仪上，按94℃20S，45℃20S，72℃40S的条件扩增30个循环。运行程序进行扩增。3）电泳检测扩增结果。琼脂糖凝胶电泳检测这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经漠化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%一2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。（1）制胶琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。（2）加样和电泳上样时一般取PCR反应液510u1，加入3u1溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。（3）检测将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点：①分辨率很强，可达1bp；②能装载的DNA量大，达每孔10ugDNA；③回收的DNA纯度高：其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2~5倍；③避免了EB迅速退色的弱点，银染的凝胶干燥后可长期保存。(1)制胶在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100u1体积凝胶的配制方法见下表。不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法3. 5%8%试剂5%12%20%26.64066. 630%丙烯酰胺溶液（ml）11.616.614
14 2）扩增 将加好样的试管置于DNA 扩增仪上，按94℃ 20S，45℃ 20S，72℃40S 的条件 扩增30 个循环。运行程序进行扩增。 3）电泳检测扩增结果。 琼脂糖凝胶电泳检测 这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量 DNA 即可进行实验。其原理是不同大小 的 DNA 分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫 外光照射下 DNA 分子发出荧光而判定其分子的大小。 用于电泳检测 PCR 产物的琼脂糖浓度常为 1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这 种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。 （1）制胶 琼 脂糖凝胶厚度约为 3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至 有些小片段 DNA 带型不易分辨。如配制 2%凝胶 100ml，称取琼脂 糖 2g 于三角瓶中，加入 100ml 0.5×TBE 液，微波炉加热 2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等 温度下降至 60℃时，加入终 浓度 0.5μg/ml 的 EB 液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。 （2）加样和电泳 上样时一般取 PCR 反应液 5~10μl，加入 3μl 溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。 电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为 0.5×TBE 液，接通电源，使样品由负 极向正极移动。60-100V 恒压电泳约 30-60 分钟。 （3）检测 将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA 产物与荧光染料 EB 形成橙黄色荧 光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳 性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一 致。 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR 扩增指纹图、多重 PCR 扩增、PCR 扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。 它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点： ①分辨率很强，可达 1bp； ②能装载的 DNA 量大，达每孔 10μgDNA； ③回收的 DNA 纯度高； ④其银染法的灵敏度较琼脂糖中 EB 染色法高 2~5 倍； ⑤避免了 EB 迅速退色的弱点，银染的凝胶干燥后可长期保存。 (1)制胶 在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。 制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备 100μl 体积凝胶的配制方法见下表。 不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法 试剂 3.5% 5% 8% 12% 20% 30%丙烯酰胺溶液（ml） 11.6 16.6 26.6 40 66.6
67.762.726.64066.6水(ml)20202020205XTBE(ml)0. 70.70. 70.70.710%过硫酸铵（ml）TEMED (ml)0.0350.0350.0350.0350.035在加入TEMED和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，完全注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。（2）加样和电泳上下槽中加入1XTBE电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNAMarker。以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。（3）银染分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml0.2%的AgNO03中于摇床上染色约10min：吸去AgN03液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2C03，静置2-3min，取出凝胶观察。4.注意事项1.试剂湿热灭菌，小管分装，防止污染。2.所用的PCR扩增管、微量移液器的吸头都要灭菌。3试剂混合时要在超净工作台中，戴上一次性手套，防止污染：要离心混匀。4.每次反应都要设置阴性和阳性对照。5．根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现非特异性扩增产物。15
15 水（ml） 67.7 62.7 26.6 40 66.6 5×TBE（ml） 20 20 20 20 20 10%过硫酸铵（ml） 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 TEMED（ml） 0.035 0.035 0.035 0.035 0.035 在加入 TEMED 和 10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置 45℃角的玻璃板内，完全注满（注 意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待 30-60 分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。 （2）加样和电泳 上下槽中加入 1×TBE 电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将 PCR 产物或限制性内切酶消化产物 2 与 1 上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样 品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的 DNA Marker。 以 2-10V/cm 电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭 电源，将胶片取出。 （3）银染 分开两块玻璃板，将凝胶片放入 100ml 银染固定液中振荡 15min，双蒸水洗 3 次，每次 2min， 然后将凝胶片转入 100ml 0.2%的 AgNO3 中于摇床上染色约 10min，吸去 AgNO3 液，用双蒸水 洗 3 次，每次 30s，加入 100ml 显色液约 7-10min，待 DNA 带显示清除时，吸去显色液，加 入固定液 Na2CO3，静置 2-3min，取出凝胶观察。 4. 注意事项 1．试剂湿热灭菌，小管分装，防止污染。 2．所用的PCR扩增管、微量移液器的吸头都要灭菌。 3．试剂混合时要在超净工作台中，戴上一次性手套，防止污染；要离心混匀。 4．每次反应都要设置阴性和阳性对照。 5．根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现非特异性扩增产物