(9)将DNA沉淀挑出，置于1、5ml离心管，75%乙醇洗涤2次，隔1h洗1次。（10)将DNA自然晾干后溶人适量TE或灭菌双蒸水中，55cC水浴消化2h，待完全溶解后置于一20cC保存。1.3DNA浓度与品质测定1.31琼脂糖凝胶电泳取TE溶解的DNA原液51，加2Ix1上样缓冲液，混匀，加入1%琼脂糖凝胶电泳，然后利用KODAK凝胶成像系统拍照，保存图片。1.3.2紫外分光光度计检测取20Ix1DNA愿液，加超纯水3m1，混匀，用紫外分光光度计测定样品OD260、OD27o、OD28o值。三、动物粪便中DNA的提取1.材料动物粪便样品在采集后立即装入灭过菌的离心管中，用DETs(DMSO/EDTA/Tris盐溶液）或无水乙醇浸泡。2.实验步骤将采集的粪便样品直接在样品管中揭碎，用均质法取样，每管取约200mg粪便进行DNA提取，提取前用0.9%的生理盐水预处理粪便以清除其中残留的乙醇。具体步骤如下：1）取200mg粪便于2mL离心管中，加入1mLCTAB裂解液（100mmolfLTfis一HC1，pH8，1.4mol/LNaC1，20mmol/LEDTA，2%CTAB)，混匀后55℃水浴2h；2）12000r/min离心5min，离心结束后移出700L上清至一无菌1.5m离心管中，弃沉淀。向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提；3)加入0.1倍体积的3mol/LNaAc，在旋涡混合器上混匀后加入1.5倍体积（加人盐之后计算的体积)预冷的无水乙醇，充分混匀后一20cI=放置0.5h～1h；4)12000r/min离心10min，吸弃上清，沉淀在室温中凉干；5）在沉淀中加入1mL异硫鼠酸胍（GuSCN)洗液（5mo1/LGuSCN，0.1mo1/LTris一HC1pH6.4)，摇匀至沉淀完全溶解：6)加入100ILL硅珠悬液，缓慢摇匀吸附DNA10min，10000r/min离心5min，吸弃上清；在硅珠沉淀中加入500IXLGuSCN洗液，混匀后10000r/min离心5min，吸弃上清并重复一次；7）离心弃上清，用500IXL70%乙醇重新洗涤沉淀2次：8）离心弃上清，将1.5m离心管置于55℃烘箱内5min烘干残余乙醇，再向硅珠沉淀中加入100LTE，震荡混匀5min洗脱DNA，最后12000r/min离心5min，移出约80L上清至无菌200txL或1.5mL离心管中保存。6
6 (9)将DNA沉淀挑出，置于1、5 ml离心管，75％ 乙醇洗涤2次，隔1 h洗1次。 (10)将DNA自然晾干后溶人适量TE或灭菌双蒸水中，55 cC水浴消化2 h，待完全溶解后置于 一20 cC保存。 1．3 DNA浓度与品质测定 1．3．1 琼脂糖凝胶电泳取TE溶解的DNA原液5 l，加2 Ixl上样缓冲液，混匀，加入1％琼脂 糖凝胶电泳，然后利用KODAK凝胶成像系统拍照，保存图片。 1．3．2 紫外分光光度计检测取20 Ixl DNA愿液 ，加超纯水3 ml，混匀，用紫外分光光度 计测定样品OD260、OD27o、OD28o值。 三、动物粪便中 DNA 的提取 l. 材料 动物粪便样品在采集后立即装入灭过菌的离心管中，用DETs(DMS0／EDTA／Tris盐溶液)或无 水乙醇浸泡。 2. 实验步骤 将采集的粪便样品直接在样品管中捣碎，用均质法取样 ，每管取约200 mg粪便进行DNA 提取，提取前用0．9％的生理盐水预处理粪便以清除其中残留的乙醇。具体步骤如下： 1) 取200mg粪便于2mL离心管中，加入l mLCTAB裂解液(100 mmolfL Tfis—HC1，pH 8，1．4 mol／L NaC1，20mmol／L EDTA，2％ CTAB)，混匀后55℃水浴2 h； 2)12 000 r／min离心5 min，离心结束后移出700L上清至一无菌1．5 mL离心管中，弃沉淀。 向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提； 3)加入0．1倍体积的3 mol／L NaAc，在旋涡混合器上混匀后加入1．5倍体积(加人盐之后计 算的体积)预冷的无水乙醇，充分混匀后一20 cI=放置0．5 h～1 h； 4)12 000 r／min离心10 min，吸弃上清，沉淀在室温中凉干； 5)在沉淀中加入1 mL异硫氰酸胍(GuSCN)洗液(5 mol／L GuSCN，0．1 mol／L Tris—HC1， pH 6．4)，摇匀至沉淀完全溶解； 6)加入100 ILL硅珠悬液，缓慢摇匀吸附DNA10 min，10 000 r／min离心5 min，吸弃上清； 在硅珠沉淀中加入500 IXL GuSCN洗液，混匀后10 000 r／min离心5 min，吸弃上清并重复 一次； 7)离心弃上清，用500 IXL 70％ 乙醇重新洗涤沉淀2次； 8)离心弃上清，将1．5 mL离心管置于55℃ 烘箱内5 min烘干残余乙醇，再向硅珠沉淀中加 入100L TE，震荡混匀5 min洗脱DNA，最后12 000 r／min离心5 min，移出约80 L上清至一 无菌200 txL或1．5 mL离心管中保存
四、从陈旧皮张提取DNA1.材料用于DNA提取的皮张样品2.DNA提取方法①剪取0.3cIr.2（约0.01g)左右的皮张标本，用消毒的解剖刀去除皮张表面的毛发及其它附着物②用消毒的剪刀将皮张剪成1～以下的微粒，置于Eppendof管中，以去离子水高速振荡洗涤三次，高速离心，倾去上层清液。③在每个Eppendof管中加入500出的消化液，54℃过夜（14h）。消化液：10mmt~11LTris—HC10.5%SDS，1mmoULCaCI~，02mglml蛋白酶K，pH8.0。④消化结束时，加入1出的1,umo11LEDTA（pH8.O）。③加入200110%的Chelex溶液，高速振荡混匀，置于沸水浴中20min4000drain离心5rain，取上清。?用等体积的酚，氯仿，异戊醇（25：24：1)抽提样品，4000rlmin离心10min，重复2～3次，③在DNA溶液中加入1，10体积3mo11L的NaAc溶液和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于一20屯，20rain。③12000dmin离心10mln，弃去上清。加入1ml预冷的75%乙醇，颠倒离心管数次，12000dmln离心3min，弃去上清。真空干燥，将干燥的沉淀物溶于适当体积的TE缓冲液中。在整个提取过程中，进行空白对比实验。7
7 四、 从陈旧皮张提取DNA 1. 材料 用于DNA提取的皮张样品 2. DNA提取方法 ①剪取0．3 cIr．2(约0．01 g)左右的皮张标本，用消毒的解剖刀去除皮张表面的毛发及其 它附着物 ② 用消毒的剪刀将皮张剪成1～ 以下的微粒，置于Eppendof管中，以去离子水高速振荡洗 涤三次，高速离心，倾去上层清液。 ③ 在每个Eppendof管中加入500出的消化液，54℃过夜(14 h)。消化液：10 mmt~llL Tris —HC1，0．5％ SDS，1 mmoUL CaCI~，0 2 mglml蛋白酶K，pH 8．0。 ④ 消化结束时，加入1出的1,umollL EDTA(pH 8．O)。 ⑤ 加入200 l 10％ 的Chelex溶液，高速振荡混匀，置于沸水浴中20 min ⑥4 000drain离心5 rain，取上清。 ⑦ 用等体积的酚，氯仿，异戊醇(25：24：1)抽提样品，4 000 rlmin离心10min，重复2～3 次， ⑧ 在DNA溶液中加入1，1O体积3mollL的NaAc溶液和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于一 2O屯，20rain。 ⑨ 12 000dmin离心10mln，弃去上清。 ⑩ 加入1 m1预冷的75％ 乙醇，颠倒离心管数次，12 000dmln离心3min，弃去上清。 ⑩ 真空干燥，将干燥的沉淀物溶于适当体积的TE缓冲液中。在整个提取过程中，进行空白 对比实验
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA1.实验原理带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。2.材料与器材(一)仪器1.恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统3．小型高速离心机4.高压灭菌锅5.紫外核酸检测仪(二)材料1.pQE-31和pUC18-CAT质粒(三)试剂1.50xTAE（50倍体积的TAE贮存液）配1000mL50xTAE：Tris242g57mL冰醋酸0.5mol / L EDTA200mLpH 8. 02.凝胶加样缓冲液(6x)溴酚蓝0.25%燕糖40%3.琼脂糖4.溴化乙锭溶液（EB）0.5μg/mL5.250bpDNA分子量标准3.实验步骤(一)制备琼脂糖凝胶根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度%线性DNA的有效分离范围/kb0. 35—600. 61—200. 70.81000
8 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 1. 实验原理 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为 分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵 敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子 在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通 过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光 条带，籍此可分析实验结果。 2. 材料与器材 (一)仪器 1．恒温培养箱 2．琼脂糖凝胶电泳系统 3．小型高速离心机 4．高压灭菌锅 5．紫外核酸检测仪 (二)材料 1．pQE-31 和 pUC18-CAT 质粒 (三)试剂 1．50xTAE(50 倍体积的 TAE 贮存液) 配 1000mL 50xTAE： Tris 242 g 冰醋酸 57 mL 0.5mol／L EDTA 200 mL pH 8.0 2．凝胶加样缓冲液(6x) 溴酚蓝 0.25％ 蔗糖 40％ 3．琼脂糖 4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5µg／mL 5． 250bp DNA 分子量标准 3. 实验步骤 (一)制备琼脂糖凝胶 根据被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度％ 线性 DNA 的有效分离范围／kb 0.3 5—60 0.6 1—20 O.7 0.8—10
0. 90.5—71. 20.4—61. 50.2—42. 00.1—3实验用1.2%琼脂糖。称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。(二)胶板的制备1.取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。4.待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。5.加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。(三)加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。(四)电泳1：接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V/cm。2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1一2cm处，停止电泳。(五)染色将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的漠化乙锭储存液即可），在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。4.实验结果在紫外灯（360nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用）。9
9 O.9 0.5—7 1.2 0.4—6 1.5 0.2—4 2.0 0.1—3 实验用 1.2％琼脂糖。称取 1.2g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加入 100mL 1xTAE 缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。 (二)胶板的制备 1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严， 不能留缝隙)。 2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 3．将冷到 60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上 形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 4．待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽 内。注意：DNA 样品孔应朝向负电极一端。 5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面 1-1.5 毫米。 (三)加样 用移液枪将已加入上样缓冲液的 DNA 样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 (四)电泳 1．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA 的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度 不要超过 5V／cm。 2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1—2cm 处，停止电泳。 (五)染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在 200mL1xTAE 缓冲液中加两滴 2mg/mL 的 溴化乙锭储存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色 20-30 分钟。注意：溴化乙锭 为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。 4. 实验结果 在紫外灯(360nm 或 254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光 条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用)
实验三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达1.实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS一PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。pGLO是将绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖启动子之后的一种表达载体。携带有pGLO的大肠杆菌在含有相应诱导物和抗菌素的条件下培养，可以表达GFP，这比不加诱导物的同样的大肠杆菌在SDS一PAGE凝胶上要多出一条明显的条带。表达的蛋白也可用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，紫光灯下可以看到诱导后的样品在凝胶上有绿色荧光条带出现。还可以通过免疫印迹染色（Western一blotting）的方法，用GFP的抗体检测表达的外源蛋白。2.仪器、材料和试剂(一)仪器1.垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子2.电泳仪3.干式恒温培养器4.微波炉(二)材料1．pGLO表达质粒转化的大肠杆菌的培养物：用阿拉伯糖诱导的和没有加阿拉伯糖诱导的(三)试剂1.1.5mol/LTris·HClpH8.8（已加SDS）2.0.5mo1/LTris·HCIpH6.8（已加SDS)3.10%SDS4.30%Acr/Bis29.2gAcr+08gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。5.10%Ap(-20℃存放）6.2x样品缓冲液2mL0.5mol/LTris·HClpHb.8甘油2mL20%SDS2mL0.1%溴酚蓝0.5mL2—β—巯基乙醇1.0mL双蒸水2.5mL7.5x电极缓冲液Tris7.5gGly36gSDS2.5g双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用8.染色液：0.2g考马斯亮蓝R250+84mL95%乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用。10
10 实验三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达 1. 实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它 是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变 性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与 SDS 结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽 链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数 间成线形关系。 pGLO 是将绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖启动子之后的一种表达载体。 携带有 pGLO 的大肠杆菌在含有相应诱导物和抗菌素的条件下培养，可以表达 GFP，这比 不加诱导物的同样的大肠杆菌在 SDS—PAGE 凝胶上要多出一条明显的条带。表达的蛋白 也可用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，紫光灯下可以看到诱导后的样品在凝胶上有绿 色荧光条带出现。还可以通过免疫印迹染色（Western—blotting）的方法，用 GFP 的抗体 检测表达的外源蛋白。 2. 仪器、材料和试剂 (一)仪器 1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子 2．电泳仪 3．干式恒温培养器 4．微波炉 (二)材料 1． pGLO 表达质粒转化的大肠杆菌的培养物：用阿拉伯糖诱导的和没有加阿拉伯糖诱 导的 (三)试剂 1．1.5mo1／L Tris·HCl pH 8.8 (已加 SDS ) 2．0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 (已加 SDS) 3．10％SDS 4．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至 100mL，过滤备用，4℃存放。 5．10％Ap (-20℃存放) 6．2x 样品缓冲液 0.5mo1／L Tris·HCl pH6.8 2mL 甘油 2mL 20％SDS 2mL 0.1％溴酚蓝 0.5mL 2—β—巯基乙醇 l.0mL 双蒸水 2.5mL 7．5x 电极缓冲液 Tris 7.5g G1y 36 g SDS 2.5g 双蒸水溶解，定容至 500mL，使用时稀释 5 倍使用 8．染色液：0.2g 考马斯亮蓝 R250 + 84mL 95％乙醇 + 20mL 冰醋酸，定容至 200mL， 过滤备用