武汉大学5表观基因组研究方法WuhanUnive一、全基因组甲基化测序二、甲基化DNA免疫共沉淀测序三、染色质免疫共沉淀测序Laboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 5、表观基因组研究方法 一、全基因组甲基化测序 二、甲基化DNA免疫共沉淀测序 三、染色质免疫共沉淀测序
武汉大学全基因组甲基化测序Wuhan Universi研究目的与内容：1、构建全基因组甲基化图谱（DNAmethylationprofiling），全面而精确了解全基因组DNA甲基化状态及其高低甲基化位点在基因组不同区域的分布情况。2、多样品间差异性甲基化区域分析全基因组Bisulfite测序（WholeGenomeBisulfiteSequencing，WGBSBisulfite-Seg）：Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的C碱基区分开来，是表观遗传学研究的经典方法。将重亚硫酸盐处理方法和高通量测序（例如IlluminaHiSeq）技术结合，能够绘制出单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，可用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型的关联；也是研究表观遗传调控的机制的基础Laboratoryofplantmolecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 一、全基因组甲基化测序 研究目的与内容： 1、构建全基因组甲基化图谱（DNA methylation profiling），全面而精确了 解全基因组DNA甲基化状态及其高低甲基化位点在基因组不同区域的分布情况。 2、多样品间差异性甲基化区域分析 全基因组Bisulfite测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS； Bisulfite-Seq ）： Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的 C碱基区分开来，是表观遗传学研究的经典方法。将重亚硫酸盐处理方法和高通量 测序（例如 Illumina HiSeq）技术结合，能够绘制出单碱基分辨率的DNA甲基化图 谱，可用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型的关联；也是研究表观遗传 调控的机制的基础
武汉大学Wuhan University全基因组甲基化测序实验技术路线基因组DNA全基因组DNA甲基化文库（DNA片段化末端修复、加A连接接头）Bisulfite处理PCR扩增lluminaHiSeg测序数据整体质量评估参考序列比对MC位点覆盖度统计甲基化位点检测A2X比对率统计甲基化水平统计差异甲基化分析A几八测序深度统计DMR相关功能注释全基因组甲基化水平统计八八DMR相关基因富集分析染色体水平甲基化密度分布A不同基因功能元件甲基化分布统计ACpG,CHG,CHH甲基化比例Laboratoryofplantmolecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 基因组DNA 全基因组DNA甲基化文库（DNA片段化末端修复、加A连接 接头 ）Bisulfite处理PCR扩增 Illumina HiSeq测序数据整体质量评估 参考序列比对 C位点覆盖度统计 甲基化位点检测 比对率统计 差异甲基化分析 甲基化水平统计 测序深度统计 DMR相关功能注释 全基因组甲基化水平统计 DMR相关基因富集分析 染色体水平甲基化密度分布 不同基因功能元件甲基化分布统计 CpG,CHG,CHH甲基化比例 全基因组甲基化测序实验技术路线
武汉大学DNANEBNextP5PrimerAdaptorUracilP7PrimerWuhan UniversityBarcode (BC)USEREnzymePCREnrichmentBC P7Fragmented DNA Input535'653433'55P7BCEnd Repair,5-Phosphorylation and dA-Tailing353inn535'35mi5in3'5P53P5A3A甲基化修饰接头A3A+亚硫酸盐处理：2i0UUUUoininm1noUUUUClean UpLaboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 甲基化修饰接头 A A A A U U U U U U U U 亚硫酸盐处理
武汉大学Wuhan University测序样品要求：样品纯度：0D260/280值在1.8-~2.0之间：RNA应去除干净样品浓度：最低浓度不低于50ng/ul样品总量：每个样品总量不少于15ng样品溶剂：应溶解在H,0或TE（pH8.0）中样品运输：DNA低温运输（-20℃）；用parafilm将管口密封好，以防出现污染测序数据质量控制：包括reads数、总base数，Q2o比例Q20位点分布图、碱基分布图测序数据预处理：包括去除总体质量偏低的reads，将质量大于20碱基所占比例小于50%的reads去除：去除3”端质量Q低于20的碱基；去除reads中所有的接头序列；去除长度小于20的测序片段(reads)Laboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 测序数据质量控制：包括reads数、总base数，Q20比例、 Q20位点分布图、碱基分布图 测序数据预处理：包括去除总体质量偏低的reads，将质量大于 20碱基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端质量Q低于20的 碱基；去除reads中所有的接头序列；去除长度小于20的测序片 段（reads） 测序样品要求： 样品纯度：OD 260/280值 在1.8 ～ 2.0之间；RNA应去除干净 样品浓度：最低浓度不低于50ng/ul 样品总量：每个样品总量不少于15ng 样品溶剂：应溶解在H2O或TE（pH8.0）中 样品运输：DNA低温运输（-20℃）； 用parafilm将管口密封好，以防出现污染