实验五从琼脂糖凝胶中回收DNA片断1.实验原理限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中。因此可以将某条特定的DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解，使DNA回溶到溶液中，再经过过柱，DNA片段被吸附到柱上，与溶液其它成分分开。经过乙醇洗涤杂质后，用TE缓冲液洗涤柱子即可回收目的DNA酶切片断。2.试剂及器材1.)器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴锅，DNA凝胶回收试剂盒的柱子。移液器吸头和1.5mL微量离心管分别进行高压灭活。2.）试剂（1）50xTAE电泳缓冲液（pH约8.5）：Tris碱242g，57.1mL冰乙酸，37.2gNazEDTA·2H20，ddwater定容至1L。使用时稀释成1x（2）1000x溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙锭溶于100mLddwater，4C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可（3）10x加样缓冲液：20%Ficoll400，0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝（4）6x加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液（5）DNA分子量标准：入DNAHindlI，Tiangen公司的MarkerII或MarkerIⅢI等（6）电泳级琼脂糖粉（7）DNA凝胶回收试剂盒3.）材料欲回收的DNA酶切产物：pET-Trx载体的EcoRI+BamHI酶切产物，pMD19-T-NK的EcoRI+BamHI酶切产物3.实验步骤1）用1xTAE配制1%琼脂糖凝胶，使用较宽的梳子制备加样孔。2）在胶上选定两个相邻的加样孔，分别加入少量（10μL）（一般选择位于凝胶的边缘）和大量（30～50μL）DNA酶切产物，电泳（方法见实验二）。16
16 实验五 从琼脂糖凝胶中回收 DNA 片断 1. 实验原理 限制性内切酶切割后的 DNA 片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖 凝胶中。因此可以将某条特定的 DNA 带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解，使 DNA 回溶到溶液中，再经过过柱，DNA 片段被吸附到柱上，与溶液其它成分分开。经过乙 醇洗涤杂质后，用 TE 缓冲液洗涤柱子即可回收目的 DNA 酶切片断。 2. 试剂及器材 1.) 器材 旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统， 微波炉，水漂，恒温水浴锅，DNA 凝胶回收试剂盒的柱子。移液器吸头和 1.5mL 微量 离心管分别进行高压灭活。 2.) 试剂 （1） 50×TAE电泳缓冲液（pH约 8.5）：Tris碱 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA·2H2 （2） 1000×溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：50mg 溴化乙锭溶于 100mL dd water，4°C 避光 储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可 O， dd water 定容至 1L。使用时稀释成 1× （3） 10×加样缓冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2 （4） 6×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液 EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚 蓝 （5） DNA 分子量标准：λDNA HindIII，Tiangen 公司的 Marker II 或 Marker III 等 （6） 电泳级琼脂糖粉 （7） DNA 凝胶回收试剂盒 3.) 材料 欲回收的 DNA 酶切产物：pET-Trx 载体的 EcoRI +BamHI 酶切产物，pMD19-T-NK 的 EcoRI +BamHI 酶切产物 3.实验步骤 1） 用 1×TAE 配制 1%琼脂糖凝胶，使用较宽的梳子制备加样孔。 2） 在胶上选定两个相邻的加样孔，分别加入少量（10μL）（一般选择位于凝胶的边缘）和 大量（30～50μL ）DNA 酶切产物，电泳（方法见实验二）
3）电泳结束后用薄塑料片（如电话卡）切下含有少量DNA酶切产物的泳道，EB染色。在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片在目的DNA带的下上下边缘各切一个小口作为标记。含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用EB染色，也不用紫外灯照射。4）将做好切口标记的凝胶条用保鲜膜包住，与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切口标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置。5）用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个事先称量过的、灭活的1.5mL微量离心管中。再称量后计算出其中胶块的重量。6）再用EB染色切除DNA以后的大胶，与小胶条并在一起在紫外灯下检查是否已把DNA带切走。7）按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA酶切产物。不同的试剂盒的操作原理相同，但步骤稍有差别，应严格按照试剂盒的说明书进行操作。例如上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作步骤：①按400μL/100mg凝胶的比例加入BindingBufferI，置于50-60℃水浴中10min，每2min混匀一次，使胶彻底熔化。②将熔化的胶溶液移到套放在2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min。③5000r/min室温离心1min。取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液。①将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μLWashSolution，5000r/min室温离心1min。③重复上一步洗涤一次。③取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回到同一个收集管中，12000r/min室温离心lmin。①将UNIQ-10柱放入一个新的1.5mL微量离心管中，在柱子膜中央加30μLElutionBuffer（或ddwater，pH>7.0），室温或37℃放置2min（55-80℃洗脱效果更好）。③8000r/min室温离心1min，离心管中的液体就是回收产物。（2）其它公司的试剂盒（如AXYGEN公司的AXYprepTMDNAGelExtractionKit）的操作步骤与上述大同小异，做实验时按照各家的产品说明书操作即可。8）可取2ul-5ul回收产物电泳，检测是否有回收到的目的DNA带。17
17 3） 电泳结束后用薄塑料片（如电话卡）切下含有少量 DNA 酶切产物的泳道，EB 染色。 在紫外灯下找到目的 DNA 带，用刀片在目的 DNA 带的下上下边缘各切一个小口作为 标记。含有大量 DNA 酶切产物的凝胶既不用 EB 染色，也不用紫外灯照射。 4） 将做好切口标记的凝胶条用保鲜膜包住，与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切 口标记估计未染色的大胶上 DNA 酶切产物的位置。 5） 用刀片切下大胶中 DNA 产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个事先称 量过的、灭活的 1.5mL 微量离心管中。再称量后计算出其中胶块的重量。 6） 再用 EB 染色切除 DNA 以后的大胶，与小胶条并在一起在紫外灯下检查是否已把 DNA 带切走。 7） 按照 DNA 凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收 DNA 酶切产物。不同的试剂盒的操作 原理相同，但步骤稍有差别，应严格按照试剂盒的说明书进行操作。例如： 上海生工 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒操作步骤： ①按 400µL/100mg 凝胶的比例加入 Binding Buffer II，置于 50-60℃水浴中 10min，每 2min 混匀一次，使胶彻底熔化。 ②将熔化的胶溶液移到套放在 2mL 收集管内的 UNIQ-10 柱中，室温放置 2min。 ③5000r/min 室温离心 1min。取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液。 ④将 UNIQ-10 柱放入同一个收集管中，加入 500µL Wash Solution，5000r/min 室温离心 1min。 ⑤重复上一步洗涤一次。 ⑥取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放回到同一个收集管中， 12000r/min 室温离心 1min。 ⑦将 UNIQ-10 柱放入一个新的 1.5mL 微量离心管中，在柱子膜中央加 30µL Elution Buffer （或 dd water，pH>7.0），室温或 37℃放置 2min（55-80℃洗脱效果更好）。 ⑧8000r/min 室温离心 1min，离心管中的液体就是回收产物。 （2）其它公司的试剂盒（如 AXYGEN 公司的 AXYprep™ DNA Gel Extraction Kit）的操作 步骤与上述大同小异，做实验时按照各家的产品说明书操作即可。 8） 可取 2μl-5μl 回收产物电泳，检测是否有回收到的目的 DNA 带