生物科学专业《生物工程实验指导》2011
生物科学专业 《生物工程实验指导》 2011
实验一烟草叶片愈伤组织诱导和植株再生选自魏群主编.生物工程技术实验指导.北京：高等教育出版社，2002：152-155[实验目的]通过诱导烟草叶片愈伤组织和植株再生，分析生长素和细胞分裂素对烟草叶片离体培养的作用，了解植物组织在离体培养条件下脱分化和再分化的特点：验证植物细胞全能性，探就离体条件下植物细胞形成完整植株的条件。[实验原理]根据Skoog和Miller提出的生长素和细胞分裂素相对浓度调节器官分化的的概念，相对的生长素浓度有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂素浓度有利于不定高芽的分化。通过改变激素的种类和浓度，有效地调节培养组织的器官分化，已经在许多植物的组织培养中得到证实，甚至在一些低等植物（如葫芦藓）中也得到了证实。[仪器、材料和试剂](一)仪器1.超净工作台2.高压灭菌锅3.光照培养箱(二)材料1.烟草幼苗2.茶乙酸(Napthylaceticacid，NAA)3.苄基氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，BA)4.2，4一二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D)5.硝酸铵（NH4NO3)6.硝酸钾(KNO3)7氯化钙（CaC12·2H20）8.硫酸镁（MgS04·7H20)9.磷酸二氢钾(KH2P04)10.碘化钾(KI)11.硼酸（H3B03）12.硫酸锰（MnS04·4H20)13.硫酸锌（ZnS04·7H20)14.钼酸钠（NaMo04·2H20)15.氯化钴（COC12·6H20）16.硫酸铜（CuS04·5H20）17.硫酸亚铁(FeS04·7H20)18.乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）19.甘氨酸（Glycine）20.烟酸(Nicotinicacid，VitaminPP)21.盐酸吡哆醇(Pyridoxine—HCl，VitaminB6)22.盐酸硫胺素（Thiamine一HCl，VitaminB1)23.肌醇(Inositol)1
1 实验一 烟草叶片愈伤组织诱导和植株再生 选自魏群主编.生物工程技术实验指导.北京：高等教育出版社，2002:152-155 [实验目的] 通过诱导烟草叶片愈伤组织和植株再生，分析生长素和细胞分裂素对烟草叶片离体培养 的作用，了解植物组织在离体培养条件下脱分化和再分化的特点；验证植物细胞全能性，探 就离体条件下植物细胞形成完整植株的条件。 [实验原理] 根据 Skoog 和 Miller 提出的生长素和细胞分裂素相对浓度调节器官分化的的概念，相对 高 的生长素浓度有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂素浓度有利于不定 芽的分化。通过改变激素的种类和浓度，有效地调节培养组织的器官分化，已经在许多植物 的组织培养中得到证实，甚至在一些低等植物(如葫芦藓)中也得到了证实。 [仪器、材料和试剂] (一)仪器 1．超净工作台 2．高压灭菌锅 3．光照培养箱 (二)材料 1．烟草幼苗 2．萘乙酸(Napthylacetic acid，NAA) 3．苄基氨基嘌呤(6-Benzylamino purine，BA) 4．2，4—二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D) 5．硝酸铵(NH4NO3) 6．硝酸钾(KNO3) 7．氯化钙(CaCl2·2H20) 8．硫酸镁(MgSO4·7H2O) 9．磷酸二氢钾(KH2PO4) 10．碘化钾(KI) 11．硼酸(H3BO3) 12．硫酸锰(MnSO4·4H2O) 13．硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 14．钼酸钠(NaMoO4·2H2O) 15．氯化钴(COCl2·6H2O) 16．硫酸铜(CuSO4·5H2O) 17．硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 18．乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 19．甘氨酸(Glycine) 20．烟酸(Nicotinic acid，Vitamin PP) 21．盐酸吡哆醇(Pyridoxine—HCl，Vitamin B6) 22．盐酸硫胺素(Thiamine—HCl，Vitamin B1) 23．肌醇(Inositol)
24糖(Sucrose)25.琼脂（Agar)26.氯化汞(HgC12)27.次氯酸钠(Sodiumhypochlorite)28.二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate，FDA)29.伊凡蓝(Evansblue)30.醋酸(Aceticacid)31.甲醇32.磷酸氢氨（(NH4)2HP04)33.酒精(95%的医用酒精，100%的工业酒精）34.三角瓶（50mL）35.棕色瓶（100mL，500mL，1000mL）36.枪形镊子37.塘瓷烧杯（500mL，1000mL)38.玻璃烧杯（100mL)39.培养皿（Φ=9cm)40解剖刀(三)试剂1.MS基本培养基贮液：大量元素/g·L"微量元素/mg·L有机营养/mg·（100mL)铁母液/g·L(10x)(100x)(100x)(100x)KINH4N0316.583Na2EDTA·2H203.73肌醇1.0005KNO0319H3B046202. 78烟酸FeS04·7H2022305CaC12·2H204. 4MnS04·4H20盐酸吡哆醇3. 7860盐酸硫胺素MgS04·7H20ZnS04·7H2020KH2P041. 7NaMo04·2H2025甘氨酸CoC12·6H202.52..5CuS04·5H202. 1 mol /L NaOH3.1mol / LHC14.生长调节剂贮液(1)10mol / L的萘乙酸溶液：称取18.6mg的萘乙酸用少量1mol/LNa0H溶解后，用水稀释并定容至100mL。(2)10~mol/L的6-苄氨基嘌呤溶液：称取22.5mg6一基氨基嘌呤，用少量1mo1/L的HC1溶解后，用水稀释并定容到100mL。5.70%或75%的消毒酒精（用95%的医用酒精配制）[实验步骤]1.培养基的配制(1)将各种贮液按比例混合，配制成MS培养基。(2)分别加入一定浓度的NAA和BA（在10-10mo1/L范围内，由学生自己设计不同浓度的生长调节剂组合）。2
2 24．蔗糖(Sucrose) 25．琼脂(Agar) 26．氯化汞(HgCl2) 27．次氯酸钠(Sodium hypochlorite) 28．二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate，FDA) 29．伊凡蓝(Evan’s blue) 30．醋酸(Acetic acid) 31．甲醇 32．磷酸氢氨((NH4)2HP04) 33．酒精(95％的医用酒精，100％的工业酒精) 34．三角瓶(50mL) 35．棕色瓶(100mL，500mL，1000 mL) 36．枪形镊子 37．搪瓷烧杯(500 mL，1000 mL) 38．玻璃烧杯(100 mL) 39．培养皿(Φ=9cm) 40．解剖刀 (三)试剂 1．MS 基本培养基贮液： 大量元素／g·L -1 (10X) 微量元素／mg·L -1 (100X) 铁母液／g·L -1 (100X) 有机营养／mg·(100 mL)-l (100X) NH4N03 16．5 KI 83 Na2EDTA·2H20 3.73 肌醇 1 000 KNO3 19 H3B04 620 FeSO4·7H2O 2．78 烟酸 5 CaCl2·2H2O 4．4 MnSO4·4H20 2 230 盐酸吡哆醇 5 MgSO4·7H20 3．7 ZnS04·7H20 860 盐酸硫胺素 1 KH2PO4 1．7 NaMo04·2H20 25 甘氨酸 20 CoCl2·6H20 2．5 CuS04·5H20 2．5 2．1 mol／L NaOH 3．1 mol／L HCl 4．生长调节剂贮液 (1)10-3 mol／L 的萘乙酸溶液： 称取 18．6 mg 的萘乙酸用少量 1 mol／L NaOH 溶解后，用水稀释并定容至 100mL。 (2)10-3 mol／L 的 6-苄氨基嘌呤溶液： 称取22．5mg 6—苄基氨基嘌呤，用少量 1 mol／L 的HCl 溶解后，用水稀释并定容到 100mL。 5．70％或 75％的消毒酒精(用 95％的医用酒精配制) [实验步骤] 1．培养基的配制 (1)将各种贮液按比例混合，配制成 MS 培养基。 (2)分别加入一定浓度的 NAA 和 BA(在 10-6 -10-7 mol／L 范围内，由学生自己设计不同浓度 的生长调节剂组合)
(3)培养基中加入3%蔗糖，0.7%琼脂。加去离子水到一定体积。(4)用1N的NaOH调pH至5.8。（5）将培养基煮沸，分装到50mL三角瓶中。每瓶15一20mL左右。用封口膜或棉塞包扎瓶口。(6)将三角瓶放入高压灭菌锅，在120~c、120000Pa下灭菌15min。待温度降低到105℃以下，打开放气阀排气后，取出三角瓶、平放冷却备用。（7）按上述方法高压灭菌去离子水，烧杯，培养血和相关用具。2.外植体的表面消毒与接种培养(1)取自烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。(2)在超净工作台（操作前开机20min）上将叶片浸于70%酒精的无菌玻璃烧杯中30s，然后移入10%的次氯酸钠溶液中5-10min（消除外植体表面的微生物）。无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗于净），每次停留3一5min。(3）将灭菌后的叶片置于无菌培养皿内，用解剖刀将无菌叶片切成5mmX5mm大小。(4)将适宜大小的外植体接种到培养基上，每个三角瓶中接人4一5块叶外植体。(5)将三角瓶置于生长箱或培养室内的培养架上。培养条件为：温度25-27℃，光周期为：光照16h和黑暗8h，光照强度约15001x左右。[实验结果]观察烟草叶外植体的器官分化，如图实验16一1所示。分化的芽叶片愈伤组织照片图示意图图实验16-1烟草叶外植体的器官分化[实验安排]整个实验在1d内完成，学生配制全部试剂和完成全部操作，利用课余时间来培养室观察记录烟草叶片愈伤组织生长、不定芽和不定根分化的情况。3
3 (3)培养基中加入 3％蔗糖，0．7％琼脂。加去离子水到一定体积。 (4)用 1N 的 NaOH 调 pH 至 5．8。 (5)将培养基煮沸，分装到 50mL 三角瓶中。每瓶 15—20 mL 左右。用封口膜或棉塞包扎 瓶口。 (6)将三角瓶放入高压灭菌锅，在 120~C、120 000Pa 下灭菌 15min。待温度降低到 105℃ 以下，打开放气阀排气后，取出三角瓶、平放冷却备用。 (7)按上述方法高压灭菌去离子水，烧杯，培养皿和相关用具。 2．外植体的表面消毒与接种培养 (1)取自烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。 (2)在超净工作台(操作前开机 20min)上将叶片浸于 70％酒精的无菌玻璃烧杯中 30s，然 后移入 10％的次氯酸钠溶液中 5-10 min(消除外植体表面的微生物)。无菌水至少洗涤 3 次(消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净)，每次停留 3—5 min。 (3)将灭菌后的叶片置于无菌培养皿内，用解剖刀将无菌叶片切成 5mmX 5 mm 大小。 (4)将适宜大小的外植体接种到培养基上，每个三角瓶中接人 4—5 块叶外植体。 (5)将三角瓶置于生长箱或培养室内的培养架上。培养条件为：温度 25-27℃，光周期为： 光照 16h 和黑暗 8 h，光照强度约 1 5001x 左右。 [实验结果] 观察烟草叶外植体的器官分化，如图实验 16—1 所示。 [实验安排] 整个实验在 1 d 内完成，学生配制全部试剂和完成全部操作，利用课余时间来培养 室观察记录烟草叶片愈伤组织生长、不定芽和不定根分化的情况
实验二烟草原生质体分离和体细胞杂交选自魏群主编.生物工程技术实验指导.北京：高等教育出版社，2002:156-160[实验目的]通过烟草叶片和愈伤组织原生质体的分离和融合，学习植物原生质体分离和体细胞杂交的一般方法，认识体细胞杂交打破物种生殖隔离，促进种质交流的特点，建立起细胞工程育种技术体系。[实验原理]原生质体是消除细胞壁的细胞部分。利用纤维素酶和果胶酶消化植物细胞壁，能获得大量的原生质体。聚乙二醇(PEG)高钙高pH融合诱导方法是体细胞杂交的主要方法之一。PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。当PEG分子链足够大时，在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，引起原生质体紧紧粘连成团。Ca2+在蛋白质或磷脂负电荷基团和PEG之间形成桥梁，加强原生质体之间的粘连作用，10mmol/LCaCI2·2H：0能完全消除烟草原生质体表面的电荷。在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电荷的不平衡和发生重新分布。质膜紧密接触区域的电荷重新分布使一原生质体的某些正电荷基团与另一原生质体的负电荷基团联结，反之亦然，最后导致原生质体发生融合。融合细胞在培养过程中再生细胞壁、分裂生长形成愈伤组织和再生植株，产生体细胞杂种植株。根据双亲遗传物质在体细胞杂种中的遗传，体细胞杂种又分为核对称杂种、核不对称杂种和细胞质杂种。本实验用于诱导核对称杂种。[仪器、材料和试剂](一)仪器1．超净工作台2.高压灭菌锅3.光照培养箱4.低速离心机5.倒置光学显微镜(二)材料1.烟草试管苗叶片和愈伤组织2.萘乙酸(Napthylaceticacid·，NAA)3.芊基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA)4.2，4一二氯苯氧乙酸(2，4一Dichlorophenoxyaceticacid，2，4—D）5.硝酸铵(NH，NO，）6.硝酸钾(KNO，）7.氯化钙(CaCI2·2H2O)8.硫酸镁(MgSO4·7H209.磷酸二氢钾(KH2P04)10.碘化钾(KI)11.硼酸(H3B03)12.硫酸锰(MnS04·4H20)13.硫酸锌(ZnS04·7H20)4
4 实验二 烟草原生质体分离和体细胞杂交 选自魏群主编.生物工程技术实验指导.北京：高等教育出版社，2002:156-160 [实验目的] 通过烟草叶片和愈伤组织原生质体的分离和融合，学习植物原生质体分离和体细胞杂交 的一般方法，认识体细胞杂交打破物种生殖隔离，促进种质交流的特点，建立起细胞工程育 种技术体系。 [实验原理] 原生质体是消除细胞壁的细胞部分。利用纤维素酶和果胶酶消化植物细胞壁，能获得大 量的原生质体。聚乙二醇(PEG)高钙高 pH 融合诱导方法是体细胞杂交的主要方法之一。PEG 带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。当 PEG 分子链足够大时，在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，引起原生质体紧紧粘连 成团。Ca2+在蛋白质或磷脂负电荷基团和 PEG 之间形成桥梁，加强原生质体之间的粘连作 用，10mmol／LCaCl2·2H：0 能完全消除烟草原生质体表面的电荷。在洗涤过程中，直接或 间接与质膜结合的 PEG 分子从原生质体表面洗脱，并随着 pH 的降低，导致膜电荷的不平衡 和发生重新分布。质膜紧密接触区域的电荷重新分布使一原生质体的某些正电荷基团与另一 原生质体的负电荷基团联结，反之亦然，最后导致原生质体发生融合。融合细胞在培养过程 中再生细胞壁、分裂生长形成愈伤组织和再生植株，产生体细胞杂种植株。根据双亲遗传物 质在体细胞杂种中的遗传，体细胞杂种又分为核对称杂种、核不对称杂种和细胞质杂种。本 实验用于诱导核对称杂种。 [仪器、材料和试剂] (一)仪器 1．超净工作台 2．高压灭菌锅 3．光照培养箱 4．低速离心机 5．倒置光学显微镜 (二)材料 1．烟草试管苗叶片和愈伤组织 2．萘乙酸(Napthylacetic acid·，NAA) 3．苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA) 4．2，4—二氯苯氧乙酸(2，4—Dichlorophenoxyacetic acid，2，4—D) 5．硝酸铵(NH，NO，) 6．硝酸钾(KNO，) 7．氯化钙(CaCl2·2H2O) 8．硫酸镁(MgSO4·7H2O 9．磷酸二氢钾(KH2P04) 10．碘化钾(K1) 11．硼酸(H3B03) 12．硫酸锰(MnS04·4H20) 13．硫酸锌(ZnS04·7H20)