北京林业大学：《生物学》课程教学资源（实验课件）基因工程实验指导（生物技术专业）

基因工程综合实验指导(生物技术专业)学校：北京林业大学2012.2.15

基因工程综合实验指导 (生物技术专业) 学 校： 北京林业大学 2012.2.15

自的基因克隆PartI实验目的1.通过PCR法分离克隆目的基因。2.熟悉掌握PCR、凝胶电泳、DNA回收纯化、PCR产物与T载体链接、大肠杆菌感受态细胞制备、连接产物转化、重组子筛选等一系列克隆相关技术实验原理基于已知序列或已知同源基因序列，设计基因特异引物或简并引物，以DNA或cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳后回收纯化，与T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经抗性筛选和PCR检测、质粒酶切鉴定获得重组子。试剂药品PCR反应试剂(TaqDNApolymerase,10×PCRBuffer(Mg2)，2.5mMdNTPs,Primers(合成))1xTAE,CaCl2，无水乙醇、LB培养基DNA回收试剂盒，质粒DNA提取试剂盒，DNAmarkerT-Vector, T4-DNA ligase,质粒DNA提取试剂盒常用限制性核酸内切酶仪器设备PCR仪、电泳装置、离心机、恒温箱、摇床、凝胶成像仪、移液器等耗材：PCR管、离心管、吸头、培养皿等实验程序, PCR1.原理：见《分子克隆》等有关手册2a.反应体系(使用Taq时)：lμlDNA模板上游引物(10pmol/μl)1μl1μl下游引物(10pmol/μl）5μl 10XPCRBuffer25mMMgCl24μl2.5mM dNTPs4μl0.5μlTaq(4,5units/μl)2

2 Part I 目的基因克隆 实验目的 1. 通过 PCR 法分离克隆目的基因。 2. 熟悉掌握 PCR、凝胶电泳、DNA 回收纯化、PCR 产物与 T 载体链接、大肠杆菌感受态细胞 制备、连接产物转化、重组子筛选等一系列克隆相关技术 实验原理 基于已知序列或已知同源基因序列，设计基因特异引物或简并引物，以 DNA 或 cDNA 为模板 进行 PCR 扩增，扩增产物电泳后回收纯化，与 T 载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞， 经抗性筛选和 PCR 检测、质粒酶切鉴定获得重组子。 试剂药品 PCR 反应试剂 (Taq DNA polymerase, 10×PCR Buffer (Mg2+)，2.5mM dNTPs, Primers(合成)) 1×TAE, CaCl2，无水乙醇、LB 培养基 DNA 回收试剂盒，质粒 DNA 提取试剂盒，DNA marker T-Vector, T4-DNA ligase, 质粒 DNA 提取试剂盒 常用限制性核酸内切酶 仪器设备 PCR 仪、电泳装置、离心机、恒温箱、摇床、凝胶成像仪、移液器等 耗材：PCR 管、离心管、吸头、培养皿等 实验程序 一. PCR 1．原理:见《分子克隆》等有关手册 2a．反应体系(使用 Taq 时)： DNA 模板 1l 上游引物(10pmol/l) 1l 下游引物(10pmol/l) 1l 10×PCR Buffer 5l 25mM MgCl2 4l 2.5mM dNTPs 4l Taq(4,5units/l) 0.5l

33.5μlddH,Ototal50μl2b.反应体系(使用Pfu时)：1μlDNA模板上游引物（10pmol/ul）3μl下游引物(10pmol/μl)3μl5μl10XPCRBuffer1μl10mM dNTP (each)Pfu(2,3units/μl)0.5μlddH2036.5μltotal50μl3模板DNA可以是基因组DNA、DNA片段、cDNA、质粒DNA或含目标DNA的细菌及病毒等，浓度一般小于100ng。4.引物设计应遵循下列原则：(1）长度一般在20-24碱基；(2）与模板DNA的配对同源性在80%以上；(3）上游引物与基因编码链序列一致，下游引物则与之互补；（4）3'未端与模板配对能力较好（最好未端5个碱基能配对）；（5）两引物G+C百分含量相近(6）3'未端不出现3个连续的G/C;（7）引物自身或两引物间不存在连续5个或5个以上碱基的互补能力；（8）两引物3'未端序列不应相近：(9）目标PCR产物的长度应能预测；（10）经GenBank同源性检索，目标基因与引物的配对能力应远强于其它基因。5.循环条件：一般情况下Tag采用月94℃,5min→（94℃40s→退火温度，40s-72℃,60-120s)30→72℃,10min。Pfu采用95℃,2min→（95℃,40s→退火温度，30s→73℃,60-240s)35→73℃,5min。退火温度是PCR成败的关键，虽然根据引物的特性可估计退火温度，但更多情况下是通过试验确定退火温度，一般为45-60℃。退火温度大致可按下式推算：Tm=4(G+C)+2(A+T)-5nn代表错配的碱基数。延伸时间Tag是每kblmin，Pfu则每kb2min。二、琼脂糖凝胶电泳1胶的浓度因DNA长度而异：基因组DNA，入DNA0.4-0.5%质粒(3-5kb)0.7%3-1kb0.7-1.0%3

3 ddH2O 33.5l total 50l 2b．反应体系(使用 Pfu 时)： DNA 模板 1l 上游引物(10pmol/l) 3l 下游引物(10pmol/l) 3l 10×PCR Buffer 5l 10mM dNTP (each) 1l Pfu(2,3units/l) 0.5l ddH2O 36.5l total 50l 3．模板 DNA 可以是基因组 DNA、DNA 片段、cDNA、质粒 DNA 或含目标 DNA 的细菌及 病毒等，浓度一般小于 100ng。 4．引物设计应遵循下列原则： (1) 长度一般在 20-24 碱基; (2) 与模板 DNA 的配对同源性在 80%以上; (3) 上游引物与基因编码链序列一致, 下游引物则与之互补; (4) 3’未端与模板配对能力较好(最好未端 5 个碱基能配对); (5) 两引物 G+C 百分含量相近; (6) 3’未端不出现 3 个连续的 G/C; (7) 引物自身或两引物间不存在连续 5 个或 5 个以上碱基的互补能力; (8) 两引物 3’未端序列不应相近; (9) 目标 PCR 产物的长度应能预测; (10) 经 GenBank 同源性检索, 目标基因与引物的配对能力应远强于其它基因。 5．循环条件： 一般情况下 Taq 采用 94℃, 5min → (94℃, 40s → 退火温度, 40s → 72℃, 60-120s)30 → 72℃, 10min。 Pfu 采用 95℃, 2min → (95℃, 40s → 退火温度, 30s → 73℃, 60-240s)35 → 73℃, 5min。 退火温度是 PCR 成败的关键，虽然根据引物的特性可估计退火温度， 但更多情况下 是通过试验确定退火温度，一般为 45-60℃。 退火温度大致可按下式推算：Tm=4(G+C)+2(A+T)-5n n 代表错配的碱基数。 延伸时间 Taq 是每 kb 1min, Pfu 则每 kb 2min。 二．琼脂糖凝胶电泳 1．胶的浓度因 DNA 长度而异： 基因组 DNA，DNA 0.4-0.5% 质粒(3-5kb) 0.7% 3-1kb 0.7-1.0%

1-0.5kb1.0-1.5%2.0%<0.5kb2.电泳缓冲液可选用0.5XTBE或1XTAE，前者缓冲能力较后者强，但不适用于从胶中回收DNA，建议只采用1XTAE用于琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖用电泳缓冲液配制。3.电泳电压以5V/cm为宜，即电泳槽的长度×5。4.电泳胶中添加0.5μg/mlEB。5.DNA样品与6X上样缓冲液混合后点样，为使DNA条带肉眼可见，条带DNA必须达2ng。6采用合适的DNAMarker。三.PCR产物与T一载体连接反应体系：0.1μg载体DNA，2-5ulPCR纯化产物，1μl连接缓冲液，lμl(3units/μl)T4DNA连接酶，加ddH20至10ul，12-16℃连接过夜。四.大肠杆菌感受态细胞制备及DNA转化感受态细胞1.挑取TG1单菌落在LB培养基中37℃过夜培养：2.过夜培养的TG1菌按1：50或1：100稀释培养1.5-2hr;3.冰上冷却10min4.4000rpm×3min,4℃离心；5.沉淀用1ml100mMCaClz悬浮，冰上放置10min;6.4000rpm×3min,4℃离心；7.沉淀用0.2ml100mMCaCl2悬浮，冰上放置30min-24hr后使用：8.将连接产物与感受态细胞混合，冰上放置30min；9.于42℃热激90s后迅速放冰上2min10.加入1mlLB(不含氨青霉素），混合后于37℃保温1hr;11.在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板(直径7cm)表面涂30μlx-gal(20mg/ml,用二甲基甲酰胺配制)和3μlIPTG(200mg/ml)，然后涂布转化后的细菌；12.37℃倒置培养10-14hr，待菌落长成后将平板置于4℃中保存。五，大肠杆菌感受态细胞的快速制备及转化1.取1ml过夜培养的细菌，置冰上10min，离心收集细菌后加入100ulTSS悬浮，置冰上10min后可用；2.加入要转化的DNA，置冰上10min;3.加入0.9ml含20mM葡萄糖的TSS,37℃培养1小时即可涂板。注：此感受态细胞可于一70℃保存4个月。六.农杆菌感受态细胞制备及冻融转化1.农杆菌稀释100倍过夜培养；2.吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3.5000rpm离心5min，弃去上清液；4

4 1-0.5kb 1.0-1.5% <0.5kb 2.0% 2. 电泳缓冲液可选用 0.5×TBE 或 1×TAE，前者缓冲能力较后者强，但不适用于从胶中 回收 DNA，建议只采用 1×TAE 用于琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖用电泳缓冲液配制。 3．电泳电压以 5V/cm 为宜, 即电泳槽的长度×5。 4. 电泳胶中添加 0.5g/ml EB。 5．DNA 样品与 6×上样缓冲液混合后点样，为使 DNA 条带肉眼可见， 条带 DNA 必须 达 2ng。 6．采用合适的 DNA Marker。 三． PCR 产物与 T－载体连接 反应体系：0.1g 载体 DNA，2-5l PCR 纯化产物，1l 连接缓冲液，1l(3units/l) T4 DNA 连接酶，加 ddH2O 至 10l，12-16℃连接过夜。 四．大肠杆菌感受态细胞制备及 DNA 转化感受态细胞 1．挑取 TG1 单菌落在 LB 培养基中 37℃过夜培养； 2．过夜培养的 TG1 菌按 1：50 或 1：100 稀释培养 1.5-2hr; 3. 冰上冷却 10min; 4. 4000rpm × 3min, 4℃离心； 5．沉淀用 1ml 100mM CaCl2 悬浮，冰上放置 10min; 6. 4000rpm × 3min, 4℃离心； 7. 沉淀用 0.2ml 100mM CaCl2 悬浮，冰上放置 30min-24hr 后使用; 8．将连接产物与感受态细胞混合，冰上放置 30min； 9．于 42℃热激 90s 后迅速放冰上 2min; 10. 加入 1ml LB(不含氨苄青霉素)，混合后于 37℃保温 1hr; 11. 在含 100g/ml氨苄青霉素的 LB固体培养基平板(直径 7cm)表面涂 30l x-gal (20mg/ml, 用二甲基甲酰胺配制)和 3l IPTG (200mg/ml), 然后涂布转化后的细菌; 12. 37℃倒置培养 10-14hr，待菌落长成后将平板置于 4℃中保存。 五. 大肠杆菌感受态细胞的快速制备及转化 1.取 1ml 过夜培养的细菌, 置冰上 10min, 离心收集细菌后加入 100l TSS 悬浮, 置冰上 10min 后可用; 2. 加入要转化的 DNA, 置冰上 10min; 3. 加入 0.9ml 含 20mM 葡萄糖的 TSS, 37℃培养 1 小时即可涂板。 注：此感受态细胞可于－70℃保存 4 个月。 六．农杆菌感受态细胞制备及冻融转化 1．农杆菌稀释 100 倍过夜培养； 2．吸取 1.5ml 菌液于离心管中，冰浴 10min； 3．5000rpm 离心 5min，弃去上清液；

七：质粒提取一一常规法1.取1ml细菌，12000rpm,15s；2.用200μlSolutionI重悬浮细菌，室温放置5min;3.加入200ulSolutionIl，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min4.加入200μlSolutionII，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；5.12000rpm,10min;6.上清液移入新离心管，加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置2min7.12000rpm,5min，吸干残液：8.溶于50μl含10μg/mlRNase的TE，37℃保温20min；（到此步骤的质粒可供电泳检查）9.补加TE至100μl,加等体积酚/氯仿，剧烈颠倒混匀1min；10.12000rpm,5min;11.上清液(上层)移入新离心管，加等体积氯仿，剧烈颠倒混匀30s；12.12000rpm,2min;13上清液(上层)移入新离心管，加1/10体积3MNaAc（pH5.2)和2倍体积乙醇，室温放置2min;14.12000rpm,2min,15.用1ml70%乙醇洗涤沉淀后，沉淀于室温或37℃干燥；16.溶于50μlTE，-20℃保存。注：提取少量质粒用于检查时，也可直接取200μl细菌，接着做步骤3，步骤4中在溶液IⅢI加入5min后加等体积氯仿/异戊醇，混匀，接着做下面步骤。八，低蛋白低DNase质粒的提取（该法无需酚/氯仿抽提）1.取1ml细菌，12000rpm15s；2.用150ulSET重悬浮细菌，室温放置5min3.加入350μlSolutionII，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；4.加入250ulSolutionIIl，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min5.12000rpm,10min;6.上清液移入新离心管，加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置2min;7.12000rpm,5min，吸干残液；8.溶于50μl含10μg/mlRNase的TE，37℃保温20min，然后-20℃保存。5

5 七．质粒提取――常规法 1．取 1ml 细菌，12000rpm, 15s； 2．用 200l Solution I 重悬浮细菌，室温放置 5min; 3. 加入 200l Solution II，轻轻颠倒混匀， 冰上放置 5min； 4. 加入 200l Solution III，轻轻颠倒混匀， 冰上放置 5min； 5．12000rpm, 10min; 6. 上清液移入新离心管，加等体积异丙醇, 颠倒混匀, 室温放置 2min; 7．12000rpm, 5min，吸干残液； 8．溶于 50l 含 10g/ml RNase 的 TE，37℃保温 20min；(到此步骤的质粒可供电泳检查) 9. 补加 TE 至 100l,加等体积酚/氯仿，剧烈颠倒混匀 1min； 10．12000rpm, 5min; 11．上清液(上层)移入新离心管，加等体积氯仿，剧烈颠倒混匀 30s； 12. 12000rpm, 2min; 13. 上清液(上层)移入新离心管，加 1/10 体积 3M NaAc (pH5.2)和 2 倍体积乙醇,室温放置 2min; 14. 12000rpm, 2min; 15. 用 1ml 70%乙醇洗涤沉淀后, 沉淀于室温或 37℃干燥; 16. 溶于 50l TE, -20℃保存。 注: 提取少量质粒用于检查时，也可直接取 200l 细菌，接着做步骤 3，步骤 4 中在溶液Ⅲ 加入 5min 后加等体积氯仿/异戊醇，混匀，接着做下面步骤。 八．低蛋白低 DNase 质粒的提取(该法无需酚/氯仿抽提) 1．取 1ml 细菌，12000rpm, 15s； 2．用 150l SET 重悬浮细菌，室温放置 5min; 3. 加入 350l Solution II，轻轻颠倒混匀， 冰上放置 5min； 4. 加入 250l Solution III，轻轻颠倒混匀， 冰上放置 5min； 5．12000rpm, 10min; 6. 上清液移入新离心管，加等体积异丙醇, 颠倒混匀, 室温放置 2min; 7．12000rpm, 5min，吸干残液； 8．溶于 50l 含 10g/ml RNase 的 TE，37℃保温 20min，然后-20℃保存