野生动物研究法-课程教学改革与实践实验室操作技术指导2011
1 野生动物研究法-课程教学改革与实践 实验室操作技术指导 2011
目录实验一动物DNA的提取T实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA.实验三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达10实验四PCR体外扩增DNA片段与扩增产物的检测分析错误！未定义书签。实验五从琼脂糖凝胶中回收DNA片断错误！未定义书签。实验六目的基因片段与载体连接错误！未定义书签。实验七RAPD和ISSR技术.20实验八SSR简单序列重复标记22实验九PCR单链构象多态性分析错误！未定义书签。24实验十DNA指纹图谱分析实验十一动物总RNA的提取及含量测定27实验十二动物组织mRNA提取实验方法34实验十三 RNA的定量和完整性分析35实验十四综合实验：逆转录PCR.38附录：常用缓冲液的配置41C
2 目录 实验一 动物DNA的提取 . 3 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA. 8 实验三 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达. 10 实验四 PCR体外扩增DNA片段与扩增产物的检测分析 . 错误！未定义书签。 实验五 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断. 错误！未定义书签。 实验六 目的基因片段与载体连接. 错误！未定义书签。 实验七 RAPD和ISSR技术. 20 实验八 SSR简单序列重复标记 . 22 实验九 PCR 单链构象多态性分析. 错误！未定义书签。 实验十 DNA指纹图谱分析. 24 实验十一 动物总 RNA 的提取及含量测定 . 27 实验十二 动物组织mRNA提取实验方法.34 实验十三 RNA的定量和完整性分析.35 实验十四 综合实验：逆转录 PCR .38 附录：常用缓冲液的配置.41
实验一动物DNA的提取新鲜组织DNA的提取一、1.实验原理生物组织中的DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中，提取前首先应粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP）和DNP往往一起被提取，DNA沉淀中混有RNA。需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA。并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知，一般以O.D260nm/O.D280nm能达到1.8左右为标准。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA含量：O.D260nmX样品稀释倍数×50ug/ml=ug/ml样品。2.试剂及器材1）：塑料离心管：62）：刻度离心管：13）.滴管：长：1吸酚：氯仿混合液中：1吸乙醇短(钝口)1吸DNA水溶液4）：细玻棒：15）：移液管：16）：微量取样器17）：手套：1副8）．离心机9）：紫外分光光度计10）：37℃水浴，50℃水浴11）：组织捣碎器12）：电泳仪及电泳槽13），裂解缓冲液：50mmol /1Tris—Hcl pH7.420mmol/IEDTA0.5%SDS100mmol/lNaCI（1mol/lTris-HCI pH7.450ml，20%SDS25ml,2mol/lNaCl50ml，0.5mol/lEDTA40ml，蒸馏水稀释至1000ml）其中Tris-HclpH7.4维持PH恒定，防止DNA变性和水解。EDTA能络合二价金属离子，当Mg+，被络合后，细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同时金属离于络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解：SDS有使蛋白质变性的作用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。14）．苯酚重蒸苯酚加入抗氧化剂8一羟喹啉1mg/ml，用1mol/lPH8.0Tris-HCl，洗一次，再用0.1mol3
3 实验一 动物 DNA 的提取 一、 新鲜组织DNA 的提取 1. 实验原理 生物组织中的DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中，提取前首先应粉碎组织，裂 解细胞膜和核膜，使DNP 释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP) 和DNP 往往一起被提取，DNA 沉淀中混有RNA。需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA。 并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的 DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm 波长处的光密度之比值测知，一般 以O.D260nm／O.D280nm 能达到1.8 左右为标准。 DNA 的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测 定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA 含量：O.D260nm×样品稀释倍 数×50ug／ml= ug/m1 样品。 2. 试剂及器材 1）．塑料离心管：6 2）．刻度离心管：1 3）. 滴管：长： 1 吸酚：氯仿混合液 中： 1 吸乙醇 短(钝口) 1 吸DNA 水溶液 4）．细玻棒：1 5）．移液管：1 6）．微量取样器1 7）．手套：1 副 8）．离心机 9）．紫外分光光度计 10）．37℃水浴，50℃水浴 11）．组织捣碎器 12）．电泳仪及电泳槽 13）．裂解缓冲液： 50mmol／l Tris—Hcl pH7.4 20mmol/lEDTA、 0.5％SDS 100mmol/l NaCl （1 mol/l Tris-HCl pH7.4 50ml，20％SDS 25ml， 2mol/l NaCl 50ml，0.5mol/l EDTA 40ml，蒸馏水稀释至 1000ml） 其中Tris-Hcl pH7．4 维持PH 恒定，防止DNA 变性和水解。EDTA 能络合二价金属离 子，当Mg+’被络合后，细胞内释放出来的DNA 酶的作用被抑制，以避免DNA 的降解， 同时金属离于络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS 有使蛋白质变性的作 用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且 SDS 也具有抑制DNA 酶的作用。 14）．苯酚 重蒸苯酚加入抗氧化剂8—羟喹啉1mg／ml，用1mol/l PH8．0 Tris-HCl，洗一次，再用0.1mol
/1Tris-HCIPH8.0，洗二次，苯酚PH在7.6-7.8之间。15）：苯酚：氯仿混和液（1：1)苯酚加上等体积氯仿并用水饱和，混和液分层，上层为水相，下层为有机相且带黄色。苯酚和气仿都是蛋白质变性剂，苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿，但氯仿具有较好的分层作用。16）：无水乙醇DNA在PH7.4条件下分于带负电，在NaCI存在条件下，DNA盐呈电中性，乙醇将DNA分子周围的水分夺去，DNA失水形成白色絮状沉淀。17）：TE缓冲液50mmol/lTris-HCIpH7.05mmol/lEDTA：（Imol/ITris-HCIpH7.410ml，0.5mol/lEDTA蒸馏水稀释至1000ml）18）：RNase10mg/ml称取RNase溶解在10mmol/1Tris-HCl(PH7.5)和15mmol/LTris一Hcl(PH7.5)和15mmol/INacl落液中使之浓度为10mg/ml。100℃加温15分钟，使夹杂的少许DNase失活，然后慢慢冷却，分装于小管中—20C保存。19）：蛋白酶K(10mg/ml）一20℃保存。蛋白酶K优点一一水解能力很强，作用广泛，可与SDS及EDTA合并使用。20）：20%SDS21).0.5mol/LEDTA22）：12mol/L高氯酸3.实验步骤1）：取新鲜鼠肝用冰生理盐水洗去血水，用滤纸吸千后，一70C冰箱中保存，用时取出。2）.1克鼠肝加10ml裂解缓冲液，在组织勾浆器中勾浆约1分钟(2次，每次1/2分钟3）：取塑料离心管1支加入1/3支匀浆液（若匀浆液太稠，则再加入ImlITE缓冲液），然后再加入等体积苯酚：氯仿混和液抽提。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，然后离心t0000转/分钟×5分钟，水相吸入另一干净的离心管中，重复抽提二次。注意：每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提二次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见。若界面上变性蛋白质仍较多，可增加抽提次数。4）：水相加入一刻度离心管中后，加入2.5倍体积的冰无水乙醇（可用刻度离心管测量体积)。加5mol/LNaGI到终浓度为0.1mol/L，在离心管中轻缓的混匀，此时可见白色絮状沉淀，此即DNA粗制品。5）：用玻棒捞起DNA沉淀，放入小烧杯中，用70%乙醇洗涤沉淀一次，洗涤时动作要轻，防止DNA被切断。6）：沉淀取出放入一干净的塑料离心管中，用ImlTE缓冲液溶解。7）：在lmlDNA溶液中加入10mg/ml的RNA酶20μ1，使最终浓度达到200ug/ml，37℃保温30分钟。8）：加入20%SDS25ul，使最终浓度至0.5%加入0.5mol/lEDTA30ul至20mmol/l加10mg/ml蛋白酶K20ul，使最终浓度为200ug/ml，50E保温30分钟。9）：加等体积苯酚：氯仿混合液抽提，重复一次，去除蛋白酶K及其它残留的蛋白质，4
4 ／1 Tris-HCl PH8.0，洗二次，苯酚PH 在7．6-7．8 之间。 15）．苯酚：氯仿混和液(1：1) 苯酚加上等体积氯仿并用水饱和，混和液分层，上层为水相，下层为有机相且带黄色。 苯酚和气仿都是蛋白质变性剂，苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿，伹氯仿具有较好的分层 作用。 16）．无水乙醇 DNA 在PH7．4 条件下分于带负电，在NaCl 存在条件下，DNA 盐呈电中性， 乙醇将DNA 分子周围的水分夺去，DNA 失水形成白色絮状沉淀。 17）．TE 缓冲液 50mmol/l Tris-HCl pH7.0 5mmol/l EDTA （l mol／l Tris-HCl pH7.4 10ml，0．5mol/l EDTA蒸馏水稀释至 1000ml） 18）． RNase 10mg/ml 称取RNase 溶解在10mmol／l Tris-HCl(PH7．5)和 15mmol／L Tris—Hcl(PH7.5)和15mmol／lNacl 落液中使之浓度为10mg／ml。 100℃加温15 分钟，使夹杂的少许DNase 失活，然后慢慢冷却，分装于小管 中—20C 保存。 19）． 蛋白酶K(10mg/m1)—20℃保存。 蛋白酶K 优点——水解能力很强，作用广泛，可与SDS 及EDTA 合并使用。 20）． 20％ SDS 21）． 0．5mol／L EDTA 22）． 12mol／L 高氯酸 3. 实验步骤 1）．取新鲜鼠肝用冰生理盐水洗去血水，用滤纸吸千后，—70C 冰箱中保存，用时取出。 2）. 1克鼠肝加10ml 裂解缓冲液，在组织匀浆器中匀浆约1 分钟(2 次，每次1／2分钟) 3）．取塑料离心管1 支加入1／3 支匀浆液(若匀浆液太稠，则再加入lmlTE 缓冲液)，然后 再加入等体积苯酚：氯仿混和液抽提。每次抽提轻缓地来回摇动5 分钟，然后离心t0000 转 ／分钟×5 分钟，水相吸入另一干净的离心管中，重复抽提二次。 注意：每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提二次后一般有机相和 水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见。若界面上变性蛋白质仍较多， 可增加抽提次数。 4）． 水相加入一刻度离心管中后，加入2．5 倍体积的冰无水乙醇(可用刻度离心管测量体 积)。加5mol／LNaGI 到终浓度为0.1mol／L，在离心管中轻缓的混匀，此时可见白色絮状 沉淀，此即DNA 粗制品。 5）． 用玻棒捞起DNA 沉淀，放入小烧杯中，用70％乙醇洗涤沉淀一次，洗涤时动作要轻， 防止DNA 被切断。 6）． 沉淀取出放入一干净的塑料离心管中，用lmlTE 缓冲液溶解。 7）． 在lmlDNA 溶液中加入10mg／ml 的RNA 酶20μl，使最终浓度达到200ug／ml，37℃ 保温30 分钟。 8）． 加入20％SDS25ul，使最终浓度至0．5％；加入0．5mol/l EDTA30ul 至20mmol/l；加 10mg／ml 蛋白酶K20ul，使最终浓度为200ug／ml，50E 保温30 分钟。 9）． 加等体积苯酚：氯仿混合液抽提，重复一次，去除蛋白酶K 及其它残留的蛋白质
至界面无明显的变性蛋白质为止。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，离心10000转/分钟X5分钟。10）：吸取水相，水相吸至一千净刻度离心管中量出积体，再加入2.5倍体积的冰无水乙醇，加5mol/LNaCI至终浓度为0.1mol/L，混匀后可得较纯的DNA沉淀，再用70%乙醇洗涤沉淀一次。11），在一干净的塑料离心管中用0.3一0.5ml缓冲液溶解沉淀，得到提纯的DNA原液。12）：吸取DNA原液100ul，用TE缓冲液稀释至3ml(1:30稀释），（若DNA原液太浓，取原液50ul，太稀则取原液200ul)。在紫外分光光度计中测定O.D260nm及O.D280nm的读数。计算：O.D260nm/O.D280nm比值，DNA浓度及DNA总量。4.注意事项1.为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须(1)匀浆时应保持低温，匀浆时间应短，勿用玻璃匀浆器。(2)实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。(3)酚抽提时勿剧烈振摇。2)保持DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性。，3)苯酚是一种强列的蛋白质变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛酚的试剂瓶盖好。4）离心时要注意管于间的重量平衡。管于要对称放置，当离心达到所需速度后再开始计时。二、 血液DNA的提取1.材料颈静脉采血10ml，肝素抗凝，人灭菌小瓶，低温带回实验室。抗凝血样12000r/mir离心10min，将红细胞沉淀、白细胞沉淀及血清分离，白细胞沉淀移人5ml的离心管中并编号，血清移人样品瓶中编号，在仅剩红细胞沉淀的离心管中加入等体积的0.9%生理盐水，洗涤离心3次后移人样品瓶并编号，一20cC保存。2．实验步骤(1)在装有白细胞沉淀的5ml离心管中，加入细胞裂解液和蛋白酶K至终浓度为100g/ml，混勾，55cC水浴消化过夜至不见有黏稠的团块。(2)在消化好的血液中加入等体积Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，4cC12000r/min离心10min，转移上清至另一离心管中。(3)重复第二步。（4)向上清液中加入等体积的饱和酚一氯仿一异戊醇（25：24：1)混合液，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，4cC12000r/min离心10min，转移上清至另一离心管中。，(5)重复第四步。(6)向上清液中加入等体积氯仿、异戊醇（24：1)混合液，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，4cC12000r/min离心10min，转移上清至另一离心管中。(7)重复第六步。(8）向上清液中加入1/10体积3mo1/LNHAc（pH值5.2)和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀DNA，待出现白色雾状沉淀后，将离心管置于一20cC冰箱2～3h或轻柔摇荡至溶液变澄清，絮状DNA沉淀清晰可见。5
5 至界面无明显的变性蛋白质为止。每次抽提轻缓地来回摇动5 分钟，离心10000 转／分钟 X5 分钟。 10）．吸取水相，水相吸至一干净刻度离心管中量出积体，再加入2．5 倍体积的冰无水乙 醇，加5mol／LNaCl 至终浓度为0．1mol／L，混匀后可得较纯的DNA 沉淀，再用70％乙 醇洗涤沉淀一次。 11）. 在一干净的塑料离心管中用0．3—0．5ml 缓冲液溶解沉淀，得到提纯的DNA原液。 12）．吸取DNA 原液100ul，用TE 缓冲液稀释至3ml(1:30 稀释)，(若DNA 原液太浓，取 原液50ul，太稀则取原液200u1)。在紫外分光光度计中测定O.D260nm 及O.D280nm 的读数。 计算：O.D260nm／O.D280nm 比值，DNA 浓度及DNA 总 量。 4. 注意事项 1). 为尽可能避免DNA 大分子的断裂，在实验过程中必须 (1)匀浆时应保持低温，匀浆时间应短，勿用玻璃匀浆器。 (2)实验中使用的吸取DNA 水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。 (3)酚抽提时勿剧烈振摇。 2). 保持DNA 活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA 变性。 ， 3). 苯酚是一种强列的蛋白质变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。 苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛酚的试剂瓶盖好。 4). 离心时要注意管于间的重量平衡。管于要对称放置，当离心达到所需速度后再开始计时。 二、 血液DNA的提取 1. 材料 颈静脉采血10 ml，肝素抗凝，人灭菌小瓶，低温带回实验室。抗凝血样12 000 r／min 离心10 min，将红细胞沉淀、白细胞沉淀及血清分离，白细胞沉淀移人5 ml的离心管中并编 号，血清移人样品瓶中编号，在仅剩红细胞沉淀的离心管中加入等体积的0．9％ 生理盐水， 洗涤离心3次后移人样品瓶并编号，一20 cC保存。 2. 实验步骤 (1)在装有白细胞沉淀的5 ml离心管中，加入细胞裂解液和蛋白酶K至终浓度为100 g／ml， 混匀，55 cC水浴消化过夜至不见有黏稠的团块。 (2)在消化好的血液中加入等体积Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10 min使溶液的两相充分混 匀，4 cC 12 000 r／min离心10 min，转移上清至另一离心管中。 (3)重复第二步。 (4)向上清液中加入等体积的饱和酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)混合液，缓慢颠倒离心管10 min使溶液的两相充分混匀，4 cC 12 000 r／min离心10min，转移上清至另一离心管中。 ’ (5)重复第四步。 (6)向上清液中加入等体积氯仿、异戊醇(24：1)混合液，缓慢颠倒离心管10 min使溶液的两 相充分混匀，4 cC 12 000 r／min离心10 min，转移上清至另一离心管中。 (7)重复第六步。 (8)向上清液中加入1／10体积3 mol／L NH Ac(pH值5．2)和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀DNA， 待出现白色雾状沉淀后，将离心管置于一20 cC冰箱2～3 h或轻柔摇荡至溶液变澄清，絮状 DNA沉淀清晰可见