氨基酸的分离鉴定——纸层析法【实验目的】1.学习氨基酸纸层析法的基本原理2.掌握氨基酸纸层析的操作技术【实验原理】纸层析是以滤纸为情性支持物的分配层析。滤纸具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：Rf-原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关本实验利用纸层析法分离氨基酸。层析点RF-原点至层析点中心的距离,X滤纸原点至溶剂前沿的距离原点【器材与试剂】图纸层析中的RR-一)器材1.层析缸(钟罩）1个2.点样毛细管（移液枪207）1个13个组3.烧杯（50-100ml）1个钟罩13个：移液枪（207）13个：烧杯（50-100ml）13个4. 培养血1 个5.量筒 1 个培养血7套：量筒13个：喷雾器3个：吹风机（或烘箱）6.喷雾器1个13个（自带）：层析滤纸（新华一号）（剪裁）：直尺及7.吹风机（或烘箱）1个铅笔，各13个；保鲜膜4卷；针线或双面胶10份：手8.层析滤纸（新华一号）（22cm*14cm）套2包9.直尺及铅笔各1个10保鲜膜11.针线或双面胶12.手套(二) 试剂 正丁醇、乙酸、亮氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、三酮分液漏斗（三）配制溶液1.扩展剂（水饱和的正丁醇和乙酸混合液）500ml*4将正丁醇和乙酸以体积比4：1在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比5：3与蒸馏水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。2. 氨基酸溶液（4种）-100ml*0.5%半光氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为0.5%）精确称取0.5g氨基酸，溶于100mL（先少取些水溶解再定容）蒸馏中，充分溶解，定容。3. 显色剂 ——1L*40.1%水合三酮正丁醇溶液
氨基酸的分离鉴定——纸层析法 【实验目的】 1.学习氨基酸纸层析法的基本原理 2.掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机 溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速度用 Rf 值表示： Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的 Rf 值是常数。 Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 本实验利用纸层析法分离氨基酸。 【器材与试剂】 （一）器材 1.层析缸(钟罩) 1 个 2.点样毛细管 （移液枪 207）1 个 3.烧杯 (50-100ml) 1 个 4.培养皿 1 个 5.量筒 1 个 6.喷雾器 1 个 7.吹风机（或烘箱）1 个 8.层析滤纸（新华一号）（22 ㎝*14 ㎝） 9.直尺及铅笔 各 1 个 10.保鲜膜 11.针线 或 双面胶 12.手套 (二) 试剂 正丁醇、乙酸、亮氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、茚三酮 分液漏斗、 (三) 配制溶液 1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)——500ml*4 将正丁醇和乙酸以体积比 4∶1 在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比 5∶3 与蒸馏 水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。 2. 氨基酸溶液 （4 种）——100ml*4 0.5%半光氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为 0.5%）。 精确称取 0.5g 氨基酸，溶于 100mL （先少取些水溶解再定容）蒸馏中，充分溶解，定容。 3. 显色剂 ——1L*4 0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 13 个组 钟罩 13 个；移液枪（207）13 个；烧杯 (50-100ml) 13 个； 培养皿 7 套；量筒 13 个；喷雾器 3 个；吹风机（或烘箱） 13 个（自带）；层析滤纸（新华一号） （剪裁）；直尺及 铅笔，各 13 个；保鲜膜 4 卷；针线 或 双面胶 10 份；手 套 2 包
【实验步骤】1 平衡检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸（或钟罩）倒置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL扩展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸（或钟罩）内，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。2.准备滤纸取滤纸（长22cm、宽14cm）一张，在纸的一端距边缘2~3m处用铅笔划一条直线A，在此直线上每间隔3cm作一记号，共做4个标记，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），如右图所示3.点样12用移液枪将各氨基酸样品分别点在这4个位置上，干后重复点样2~3次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。4.扩展用线将滤纸缝成筒状（双面胶黏贴），纸的两边不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养血迅速置于密闭的层析缸（或钟罩）中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升15~20cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。5.显色用喷雾器均匀喷上0.1%三酮正丁醇溶液，然后用吹风机吹干或者置烘箱中（100℃）烘烤5min即可显出各层析斑点。6.计算计算各种氨基酸的 Rf 值。【要点提示】1.取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；如条件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在洁净的纸上，不可放在实验台上，以防止污染。2.点样点的直径不能大于0.5cm，否则分离效果不好，并且样品用量大会造成拖尾巴”现象。3.在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点要高于培养皿中扩展剂液面约1cm。由于各氨基酸在流动相（有机溶剂）和固定相（滤纸吸附的水）的分配系数不同，当扩展剂从滤纸一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离。【思考题】安排1.纸层析法的原理是什么？2个同学写板报2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？2个同学收器Ⅲ、洗器皿2个同学还器血、找器血、发器皿2个同学找试剂、配试剂、分试剂
【实验步骤】 1 平衡 检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内 120℃烘干。 剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸（或钟罩）倒置于塑料薄膜上，再把盛有约 20mL 扩展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸（或钟罩）内，用塑料薄膜密封起来，平衡 20min。 2.准备滤纸 取滤纸（长 22 ㎝、宽 14 ㎝）一张，在纸的一端距边缘 2～3 ㎝处用铅笔划一条直线 A，在 此直线上每间隔 3 ㎝作一记号，共做 4 个标记， 这就是原点的位置。 另在距左边缘 1cm 处画一条平行于左边缘的直线 B，在 B 线上以 A、B 两线的交点为原点 标明刻度（以厘米为单位），如右图所示。 3.点样 用移液枪将各氨基酸样品分别点在这 4 个位置上， 干后重复点样 2～3 次。每点在纸上扩散的直径最 大不超过 3mm。 4.扩展 用线将滤纸缝成筒状（双面胶黏贴），纸的两边不能接触。将盛有约 20ml 扩展剂的培养皿 迅速置于密闭的层析缸（或钟罩）中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂 的液面需低于点样线 1 ㎝）。待溶剂上升 15～20 ㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界 线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5.显色 用喷雾器均匀喷上 0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后用吹风机吹干或者置烘箱中（100℃）烘烤 5min 即可显出各层析斑点。 6.计算 计算各种氨基酸的 Rf 值。 【要点提示】 1.取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；如 条件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在洁净的纸上，不可放在实验台上， 以防止污染。 2.点样点的直径不能大于 0.5 ㎝，否则分离效果不好，并且样品用量大会造成“拖尾巴” 现象。 3.在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点要高于培养皿中扩展剂液面约 1cm。由于各 氨基酸在流动相（有机溶剂）和固定相（滤纸吸附的水）的分配系数不同，当扩展剂从滤纸 一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离。 【思考题】 1.纸层析法的原理是什么？ 2.何谓 Rf 值？影响 Rf 值的主要因素是什么？ 安排 2 个同学 写板报 2 个同学 收器皿、洗器皿 2 个同学 还器皿、找器皿、发器皿 2 个同学 找试剂、配试剂、分试剂