②增加引物的长度;③调整引物与模板浓度,使模板比例増髙,降低引物使用浓 度;④增加复性温度;⑤减少热循环次数。 (4)PCR产物在凝胶电泳中成片状:①减少 Taq dna聚合酶的用量:②增 加复性温度,减少复性时间及延伸时间;③降低Mg2浓度;④减少循环次数: ⑤从凝胶中回收与预期分子量相同的DNA,再次进行PCR反应 3.实验安全 溴化乙锭是强诱变剂,并有中度毒性,取用含有这一染料的溶液时务必戴上 手套,这些溶液经使用后,应进行净化处理 第二节单链构象多态性(SSCP)分析 单链构象多态性( single strand conformation polymorphism,SSCP)分析是 利用DNA或RNA单链构象具有多态性的特点,结合PCR进行基因检测的一种 分析技术,称为 PCR-SSCP技术。其基本原理为:DNA或cDNA在变性后,由 于序列的不同而导致单链DNA的空间结构各异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 的过程中,不同空间结构的单链DNA迁移率存在差异。因此, PCR-SSCP可以 用来鉴定单核苷酸的差异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测 遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域 PCR-SSCP的敏感性随核苷酸片段长度的增加而降低,在检测200个核苷酸 片段中单个碱基的突变时,检出率高达90%;而400个核苷酸片段单个碱基突变 的检出率为80%。因而,在实验中要将大片段分成较短的片段。哺乳动物基因组 中的外显子一般小于300个碱基,可以使用内含子引物直接对目的片段进行 PCR-SSCP。 、 PCR-SSCP技术的基本程序 PCR-SSCP技术的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产 物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰 胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取 决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有 一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部
②增加引物的长度；③调整引物与模板浓度，使模板比例增高，降低引物使用浓 度；④增加复性温度；⑤减少热循环次数。 （4）PCR 产物在凝胶电泳中成片状：①减少 Taq DNA 聚合酶的用量；②增 加复性温度，减少复性时间及延伸时间；③降低 Mg2+浓度；④减少循环次数； ⑤从凝胶中回收与预期分子量相同的 DNA，再次进行 PCR 反应。 3. 实验安全 溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上 手套，这些溶液经使用后，应进行净化处理。 第二节 单链构象多态性（SSCP）分析 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）分析是 利用 DNA 或 RNA 单链构象具有多态性的特点，结合 PCR 进行基因检测的一种 分析技术，称为 PCR-SSCP 技术。其基本原理为：DNA 或 cDNA 在变性后，由 于序列的不同而导致单链 DNA 的空间结构各异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 的过程中，不同空间结构的单链 DNA 迁移率存在差异。因此，PCR-SSCP 可以 用来鉴定单核苷酸的差异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、 遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 PCR-SSCP 的敏感性随核苷酸片段长度的增加而降低，在检测 200 个核苷酸 片段中单个碱基的突变时，检出率高达 90%；而 400 个核苷酸片段单个碱基突变 的检出率为 80%。因而，在实验中要将大片段分成较短的片段。哺乳动物基因组 中的外显子一般小于 300 个碱基，可以使用内含子引物直接对目的片段进行 PCR-SSCP。 一、PCR-SSCP 技术的基本程序 PCR-SSCP 技术的基本程序为：首先 PCR 扩增特定靶序列，然后将扩增产 物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰 胺凝胶中电泳时，DNA 单链的迁移率除与 DNA 链的长短有关外，更主要的是取 决于 DNA 单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA 单链可自身折叠形成具有 一定空间结构的构象。这种构象由 DNA 单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部
顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同,甚 至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同。PCR产物变性后, 单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,靶DNA中含单碱基置换,或数个碱基插 入或缺失等改变时,因迁移率变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常 DNA区分开。由此可见, PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术, 它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变 化来检测基因变异 二、实验准备 (一)试剂 甲酰胺加样缓冲液(95%甲酰胺,20 mMOL/L EDTA,0.05%溴酚蓝和0.05% 甲苯青)、6%丙烯酰胺(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺=49:1)、10%甘油 0.5×TBE、10%醋酸、2%硝酸银、显影液(3%无水碳酸钠,0.2%甲醛,0.02%硫 代硫酸钠)、去离子水 (二)实验仪器 PCR扩增仪、超净工作台、髙速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测 仪 、实验步骤 1.目的片段的PCR及其产物的变性根据扩增的目的片段制定PCR扩增 条件。PCR扩增结束后,用5倍体积的甲酰胺加样缓冲液混合。将样品于95℃ 变性5min并直接置于冰浴上。 2.电泳电泳胶有两种:①聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺、10%甘油和 0.5×TBE组成。上样5μ,在室温下0.5W/cm,用0.5×BE电极缓冲液电泳25h 以上;②聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺和0.5×TBE组成。上样5μ,在4℃下 0.5Wcm,用0.5×TBE电极缓冲液电泳25h以上 3.染色取下凝胶,置10%醋酸固定液中30min,再以去离子水漂洗3次 (2min次),加入2%硝酸银染液染色20min后,去离子水洗胶20s,凝胶置显 影液中显色5~10min,以10%醋酸终止反应,漂洗及分析结果 4.结果判读SSCP结果判读的标准是正常个体由于等位基因相同,仅存在 两条单链,因此在凝胶上多出现两条带,有时由于两条链接近可形成一条带,或
顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的 DNA 单链其顺序不同，甚 至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR 产物变性后， 单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶 DNA 中含单碱基置换，或数个碱基插 入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异 DNA 与正常 DNA 区分开。由此可见，PCR-SSCP 分析技术是一种 DNA 单链凝胶电泳技术， 它根据形成不同构象的等长 DNA 单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变 化来检测基因变异。 二、实验准备 （一）试剂 甲酰胺加样缓冲液（95%甲酰胺，20mmoL/L EDTA，0.05%溴酚蓝和 0.05% 二甲苯青）、6%丙烯酰胺（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺=49∶1）、10%甘油、 0.5×TBE、10%醋酸、2%硝酸银、显影液（3%无水碳酸钠，0.2%甲醛，0.02%硫 代硫酸钠）、去离子水 （二）实验仪器 PCR 扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测 仪。 三、实验步骤 1．目的片段的 PCR 及其产物的变性 根据扩增的目的片段制定 PCR 扩增 条件。PCR 扩增结束后，用 5 倍体积的甲酰胺加样缓冲液混合。将样品于 95℃ 变性 5min 并直接置于冰浴上。 2．电泳 电泳胶有两种：①聚丙烯酰胺凝胶由 6%丙烯酰胺、10%甘油和 0.5×TBE 组成。上样 5μl，在室温下 0.5W/cm，用 0.5×TBE 电极缓冲液电泳 2.5h 以上；②聚丙烯酰胺凝胶由 6%丙烯酰胺和 0.5×TBE 组成。上样 5μl，在 4℃下 0.5 W/cm，用 0.5×TBE 电极缓冲液电泳 2.5h 以上。 3．染色 取下凝胶，置 10%醋酸固定液中 30min，再以去离子水漂洗 3 次 （2min/次），加入 2%硝酸银染液染色 20min 后，去离子水洗胶 20s，凝胶置显 影液中显色 5～10min，以 10%醋酸终止反应，漂洗及分析结果。 4．结果判读 SSCP 结果判读的标准是正常个体由于等位基因相同，仅存在 两条单链，因此在凝胶上多出现两条带，有时由于两条链接近可形成一条带，或