第六章可见紫外分光光度法 ·、分光光度法的基本概念 分光光度法是根据物质对光具有选择性的吸收特征而建立起来的一种分析方法，通常又称吸 收光谱法。吸收光谱是可见光谱、紫外光谱和红外光谱的统称。 吸收光谱是由物质吸收光能而产生。光具有波粒二重性，它既是电磁波又是辐射能。 (一)光的波动性 光作为电磁波，具有波动性的特征，可用波长（入）、率(v)及波数(。)来表示 三者的关系可用以下表示。 (6-1) 1 (6-2) 式中： 波长 c一一光速 一频率 g一一波数，为每厘米长度中波的数目，即波长的倒数，单位为1cm。 (一)光的微粒性一一些朗克公式 光作为辐射能又具有微粒性的特征。所谓微粒性，即指光是由光量子（或光子）的一 种粒子组成。光辐射的能量是一份一份的。单个光量子的能量与波长的关系可用普朗克 (plank)公式表示 E=加=h贷=c (6-3) 式中：E 一能量 普朗克常量 从公式(6一3)可见，光量子的波长与其能量成反比，波长愈长，能量愈小。 (三)可见紫外、红外光区的划分 根据电磁波具有波粒二重性的特点，可把自然界存在的各种电磁波按波长顺序排列成 谱，称为电磁波谱，如表6一1所示 表6-1电磁波谱 光谱区 被长花围 动形式 X射线 0.110nm 原子内显电子获 真空紫外 分子 2.1 分中原子外层电子获迁 近红外光风 0.75-2.5m 1.2 分下中涉及氢原子的报动 红外光区 2.5-501m 0.12 分子中原子的振动及分子转动 远红外光以 60一1000μm 10- 分子的转动 餐被区 1000-3×10μm 10 分子的找动 可将电磁波波长划分为若干波段区域，如X射线区、远紫外区、可见光区和红外光区 等，从表6一1可以看出各区的波长一次上升，而其能量则依次下降，各波段能量不同，引 起物质运动的形式亦不同。物质吸收紫外光和可见光则引起分子中价电子的跃迁：物质吸收 红外光则引起分子振动，因此可见紫外光谱又称为电子光谱，红外光谱又称为分子振动光谱
第六章 可见紫外分光光度法 一、分光光度法的基本概念 分光光度法是根据物质对光具有选择性的吸收特征而建立起来的一种分析方法，通常又称吸 收光谱法。吸收光谱是可见光谱、紫外光谱和红外光谱的统称。 吸收光谱是由物质吸收光能而产生。光具有波粒二重性，它既是电磁波又是辐射能。 （一）光的波动性 光作为电磁波，具有波动性的特征，可用波长（λ）、频率（v）及波数（σ）来表示。 三者的关系可用以下表示。 c v ＝ ， c v ＝ （6－1） 1 ＝ （6－2） 式中：λ——波长 c——光速 v——频率 σ——波数，为每厘米长度中波的数目，即波长的倒数，单位为 1/cm。 （二）光的微粒性——普朗克公式 光作为辐射能又具有微粒性的特征。所谓微粒性，即指光是由光量子（或光子）的一 种粒子组成。光辐射的能量是一份一份的。单个光量子的能量与波长的关系可用普朗克 （plank）公式表示 c 1 E hv h hc ＝ ＝ ＝ （6－3） 式中：E——能量； h——普朗克常量 从公式（6－3）可见，光量子的波长与其能量成反比，波长愈长，能量愈小。 （三）可见紫外、红外光区的划分 根据电磁波具有波粒二重性的特点，可把自然界存在的各种电磁波按波长顺序排列成 谱，称为电磁波谱，如表 6－1 所示。 可将电磁波波长划分为若干波段区域，如 X 射线区、远紫外区、可见光区和红外光区 等，从表 6－1 可以看出各区的波长一次上升，而其能量则依次下降，各波段能量不同，引 起物质运动的形式亦不同。物质吸收紫外光和可见光则引起分子中价电子的跃迁；物质吸收 红外光则引起分子振动，因此可见紫外光谱又称为电子光谱，红外光谱又称为分子振动光谱
本章讨论可见及紫外分光光度法，由于可见紫外吸收光谱是由电子跃迁产生的，因此 被长为10一80如m的炎线大有足够的能量引志典子跃在这个流遇内又可分为三个区城 -200mm为远紫外区：200-400nm为近紫外区：400-800nm为可见光区域 二、可见紫外分光光度十 分光光度法使用的仪器是分光光度计。分光光度计的种类很多，其仪器结构的主要部 件都是由光源、分光系统（单色器）、吸收池、检测器和记录仪所组成。见图6一1。 )光湿 在可见紫外分光光度计上常用的光源是钨丝灯和氢弧灯（或氘灯），可见光区用钨丝白 炽灯，其波长在320-2500nm之间。紫外光区用氢弧灯或氘灯，其波长在180一375nm。现 代化的光谱仪能在可见紫外区整个扫描过程中，自动更换光源。在相同条件下，氘灯的辐射 强度比氢灯约大4倍。用氢灯或氘灯打作为光源，灯管上必须装有石英窗（因玻璃对紫外光右 吸收)，灯管内充有低压的氢或氘气体，管内还插有一对电极，当施加 定电压的脉冲后 即激发气体分子发出连续的紫外光。灯泡固定在预先校准焦点的灯座上，发出的光经聚焦后 直接射入入光狭缝，而进入单色器。 色 M M. G M. 图61可见外分光先亮资 路示意图 片 连续变化奖链：M M:- (二)单色器 单色器是指能将不同波长的入射光分散为单色光的装置，主要由透镜（聚焦作用）、输 入输出狭缝（阻挡不需要的光）和散射装置（把白色光散成不同波长的光，是一种分辨器） 组成。散射器是单色器的核心，由棱镜或衍射光组成。玻璃棱镜只能用于可见光区：石英 棱镜或反射光栅可用于紫外、可见及近红外光区。 棱镜的色散原理：不同波长的光在玻璃或石英中的折射率不同，波长短的光折射率大， 波长长的光折射率小，当平行的混合光经过棱镜后，就会使不同波长的光按次序偏折分开， 而成光谱。其光波由紫外线到长波方向越来越密。棱镜形状不一，有的是30一60一90°角
本章讨论可见及紫外分光光度法，由于可见紫外吸收光谱是由电子跃迁产生的，因此 波长为100－800nm的光线才有足够的能量引起电子跃迁。在这个范围内又可分为三个区域， 100－200nm 为远紫外区；200－400nm 为近紫外区；400－800nm 为可见光区域。 二、可见紫外分光光度计 分光光度法使用的仪器是分光光度计。分光光度计的种类很多，其仪器结构的主要部 件都是由光源、分光系统（单色器）、吸收池、检测器和记录仪所组成。见图 6－1。 （一）光源 在可见紫外分光光度计上常用的光源是钨丝灯和氢弧灯（或氘灯），可见光区用钨丝白 炽灯，其波长在 320－2500nm 之间。紫外光区用氢弧灯或氘灯，其波长在 180－375nm。现 代化的光谱仪能在可见紫外区整个扫描过程中，自动更换光源。在相同条件下，氘灯的辐射 强度比氢灯约大 4 倍。用氢灯或氘灯作为光源，灯管上必须装有石英窗（因玻璃对紫外光有 吸收），灯管内充有低压的氢或氘气体，管内还插有一对电极，当施加一定电压的脉冲后， 即激发气体分子发出连续的紫外光。灯泡固定在预先校准焦点的灯座上，发出的光经聚焦后 直接射入入光狭缝，而进入单色器。 （二）单色器 单色器是指能将不同波长的入射光分散为单色光的装置，主要由透镜（聚焦作用）、输 入输出狭缝（阻挡不需要的光）和散射装置（把白色光散成不同波长的光，是一种分辨器） 组成。散射器是单色器的核心，由棱镜或衍射光栅组成。玻璃棱镜只能用于可见光区；石英 棱镜或反射光栅可用于紫外、可见及近红外光区。 棱镜的色散原理：不同波长的光在玻璃或石英中的折射率不同，波长短的光折射率大， 波长长的光折射率小，当平行的混合光经过棱镜后，就会使不同波长的光按次序偏折分开， 而成光谱。其光波由紫外线到长波方向越来越密。棱镜形状不一，有的是 30－60－90°角
有的是正三角形。棱镜又分透射井和反射镜两种。反射镜是在背面镀一层铝，使光射到铝面 上又反射回去。光栅的色散原理：光栅是在石英或玻璃表面上刻划许多等距离的平行线，大 约每245 m刻1500 30000条线 刻线处不这 光 光只能在两条刻线 间的平面 处透过 去。这些平面形成极微小的缝，光透过小缝时即产生绕射现象。较长的光波偏折的角度大 较短的光波偏折角度小：并对各小缝射出的光在传播过程中其干涉使用。刻的线愈密，色散 程度大，光栅也有透射和反射两种。 从棱镜或光橱射出的光经旋转反射镜就可依次射出狭缝，经聚焦后达到吸收池。旋转 速度与记录器扫描速度是同步的，因此，可将各种波长的光被吸收的情况连续记录下来，而 成为吸收 现代高级分光光度计往往采用双单色器，即包含两个光栅或两个棱镜，或一个棱镜一 个光梧，这样可以减少杂散光，提高仪器的分辨能力。 (三)吸收池 贵吸及修是用以路样秀高波行定的容乳·可见水区用支吸收设泡清度 紫外区需用石 池厚 般使用lcm的 定影响很大，透明光学面不得用手指拿，不得用毛刷等硬物擦洗，通常用擦镜纸擦洗。测定 时如遇挥发性液体或气体，需盖上池盖，以免溶液挥发影响测定浓度或产生气体损害仪器部 件。 检测器的功能是检测光信号并将其转变为电信号 检测器主要部件为光电池或光电倍 增管等。光电倍增管是当前应用最多的一种检测器，它的作用是利用二次电子发射以放大为 电流，放大倍数可达103倍。对检测器的要求是灵敏度高、对辐射相应时间短、对辐射能量 相应的线性关系良好、噪音小、性能稳定等。 (五)测量信号指示系统 用光电倍增管作检测器，需要将检测器信号放大以后用记录器记录下来，不同型号分 光光度计记录装置不同，目前许多由微处理机控制的紫外可见分光光度计，可自动调零，自 动筛选波长，自动设置参数、扫描与计算均自动完成，大大减少了人为误差。 三、分光光度法的基本定律 (一)光吸收定律 用分光光度法进行定量分析是以朗伯一比尔定律(Lambert-一Beer's Law)为依据的 它是描述各种类型的电磁辐射被介质吸收规律的基本定律，简称比尔定律，定律具体内容是 当一束平行的单色光()射入具有平行平面的吸光介质（溶液）时，一部分()透过介质 (溶液)，一部分光被介质（溶液）所吸收。光的强度随介质的厚度及吸光物质的浓度的递 增而依指数规律递减。基本公式如下： 式中：A 吸光度(absorbence -透光度(transmittance)或称透射率 lo- 入射光强度： 一一诱过逼度： 光程长度即样品溶液的厚度（通常为吸收池的厚度） 样品溶液的浓度： A吸光系数(absorptivity)· 根据公式可见，当光程固定时，溶液的吸光度(A)与溶液的浓度(C)成正比关系。 当溶液浓度(C)周定时，吸光度(A)与光程长度(L)成正比关系。此公式一般适合于稀
有的是正三角形。棱镜又分透射井和反射镜两种。反射镜是在背面镀一层铝，使光射到铝面 上又反射回去。光栅的色散原理：光栅是在石英或玻璃表面上刻划许多等距离的平行线，大 约每 2.45cm 刻 15000－30000 条线。刻线处不透光，光只能在两条刻线中间的平面处透过 去。这些平面形成极微小的缝，光透过小缝时即产生绕射现象。较长的光波偏折的角度大， 较短的光波偏折角度小；并对各小缝射出的光在传播过程中其干涉使用。刻的线愈密，色散 程度大，光栅也有透射和反射两种。 从棱镜或光栅射出的光经旋转反射镜就可依次射出狭缝，经聚焦后达到吸收池。旋转 速度与记录器扫描速度是同步的，因此，可将各种波长的光被吸收的情况连续记录下来，而 成为吸收光谱图。 现代高级分光光度计往往采用双单色器，即包含两个光栅或两个棱镜，或一个棱镜一 个光栅，这样可以减少杂散光，提高仪器的分辨能力。 （三）吸收池 吸收池是用以盛装样品溶液进行测定的容器。可见光区用玻璃吸收池；紫外区需用石 英吸收池。池厚（内径）有 0.5，1，2cm 等几种，一般使用 1cm 的，吸收池的光洁度对测 定影响很大，透明光学面不得用手指拿，不得用毛刷等硬物擦洗，通常用擦镜纸擦洗。测定 时如遇挥发性液体或气体，需盖上池盖，以免溶液挥发影响测定浓度或产生气体损害仪器部 件。 （四）检测器 检测器的功能是检测光信号并将其转变为电信号。检测器主要部件为光电池或光电倍 增管等。光电倍增管是当前应用最多的一种检测器，它的作用是利用二次电子发射以放大光 电流，放大倍数可达 108 倍。对检测器的要求是灵敏度高、对辐射相应时间短、对辐射能量 相应的线性关系良好、噪音小、性能稳定等。 （五）测量信号指示系统 用光电倍增管作检测器，需要将检测器信号放大以后用记录器记录下来，不同型号分 光光度计记录装置不同，目前许多由微处理机控制的紫外可见分光光度计，可自动调零，自 动筛选波长，自动设置参数、扫描与计算均自动完成，大大减少了人为误差。 三、分光光度法的基本定律 （一）光吸收定律 用分光光度法进行定量分析是以朗伯－比尔定律（Lambert－Beer’s Law）为依据的， 它是描述各种类型的电磁辐射被介质吸收规律的基本定律，简称比尔定律。定律具体内容是： 当一束平行的单色光（I0）射入具有平行平面的吸光介质（溶液）时，一部分（I）透过介质 （溶液），一部分光被介质（溶液）所吸收。光的强度随介质的厚度及吸光物质的浓度的递 增而依指数规律递减。基本公式如下： 式中：A——吸光度（absorbence） T——透光度（transmittance）或称透射率； I0——入射光强度； I——透过强度； L——光程长度即样品溶液的厚度（通常为吸收池的厚度）； C——样品溶液的浓度； K—— (absorptivity) A LC 吸光系数 。 根据公式可见，当光程固定时，溶液的吸光度（A）与溶液的浓度（C）成正比关系。 当溶液浓度（C）固定时，吸光度（A）与光程长度（L）成正比关系。此公式一般适合于稀
溶液，也可用于气体或固体。 在具体应用时，被测溶液浓度可用moL或百分浓度来表示 用molL来表示时，用L为lcm比色池，相应的吸光系数称为摩尔吸光系数(mola absorptivity)用符号e表示 用百分浓度g100ml来表示时，L为lcm比色池，相应吸光系数称为百分吸光系数，用 符号E“表示。 E与E的关系如下： Ei=10x6 式中 m一一物质的分子量 &=E“×0.1m 。和E“的计算方法示例： 将三环唑纯品（分子量为189.24）用氯仿配成浓度为0.004%（即40mgL)的溶液， 在292nm处，用1cm比色池测得吸光度A=0.51,求在此浓度下e和E%值。 是 0.51 ，1x004/100×100=24x10 31 189.24 E=10x6=10x34x10=13x10 m 189.24 测定e值得意义： (1)根据e值的大小，可以确定化合物吸光度的强弱，e值>10为强吸收，e=103 10为较强吸收，e=102一103为较弱吸收，c<10为弱吸收。 (2)值大小与电子跃迁种类及电子在两个能级间跃迁的几率有关，如不饱和双键化 合物，可以 *跃迁，值则很大，属于强吸收。又如n一o及一*跃迁，所需 能量相差不多，但二者中I一n◆跃迁几率较大，因此©值比n一o◆的大，约为10，属强 吸收. (3)e值可以衡量不同物质在同一波长下吸收能力的强弱，在同一波长下，©值越大吸 收光能力愈强。 (4)对同一化合物而言， 在不同波长下具有不同的e值，但在一定波长下，它又是 个特征常数，因此可作为有机化合物定性鉴定的参数之一 (5)e值是衡量分析灵敏度高低的依据之一，e值越大，灵敏度越高。 (二)吸收曲线 吸收曲线又称为光普曲线或光吸收曲线，是指用固定浓度及吸收池的厚度，在不同被 长下用分光光度计测得相应的吸光度()然后以波长为横坐标，吸光度值为纵坐标作图 所得的吸光度一波长曲线，即为吸收曲线。如图6一2所示
溶液，也可用于气体或固体。 在具体应用时，被测溶液浓度可用 mol/L 或百分浓度来表示。 用 mol/L 来表示时，用 L 为 1cm 比色池，相应的吸光系数称为摩尔吸光系数（molar absorptivity）用符号ε表示 用百分浓度 g/100ml 来表示时，L 为 1cm 比色池，相应吸光系数称为百分吸光系数，用 符号 1 E1cm ％ 表示。 E 与ε的关系如下： 1 1cm 10 E m ％ ＝ 式中： m——物质的分子量 1 E 0.1 1cm m ＝ ％ ε和 1 E1cm ％ 的计算方法示例： 将三环唑纯品（分子量为 189.24）用氯仿配成浓度为 0.004％（即 40mg/L）的溶液， 在 292nm 处，用 1cm 比色池测得吸光度 A＝0.51，求在此浓度下ε和 1 E1cm ％ 值。 0.51 3 2.4 10 0.004 100 1000 1 189.24 A A LC WL m ＝ ＝ ＝ ＝ 3 1 2 1cm 10 10 2.4 10 E 1.3 10 m 189.24 ％＝ ＝ ＝ 测定ε值得意义： （1）根据 e 值的大小，可以确定化合物吸光度的强弱，e 值＞104 为强吸收，e＝103－ 104 为较强吸收，e＝102－103 为较弱吸收，e＜102 为弱吸收。 （2）e 值大小与电子跃迁种类及电子在两个能级间跃迁的几率有关，如不饱和双键化 合物，可以产生π→π*跃迁，e 值则很大，属于强吸收。又如 n→σ*及π→π*跃迁，所需 能量相差不多，但二者中π→π*跃迁几率较大，因此 e 值比 n→σ*的大，约为 104，属强 吸收。 （3）e 值可以衡量不同物质在同一波长下吸收能力的强弱，在同一波长下，e 值越大吸 收光能力愈强。 （4）对同一化合物而言，在不同波长下具有不同的 e 值，但在一定波长下，它又是一 个特征常数，因此可作为有机化合物定性鉴定的参数之一。 （5）e 值是衡量分析灵敏度高低的依据之一，e 值越大，灵敏度越高。 （二）吸收曲线 吸收曲线又称为光谱曲线或光吸收曲线，是指用固定浓度及吸收池的厚度，在不同波 长下用分光光度计测得相应的吸光度（A）然后以波长为横坐标，吸光度值为纵坐标作图， 所得的吸光度－波长曲线，即为吸收曲线。如图 6－2 所示
被长() 1一一吸牧峰，2 4一末提吸收 曲线的峰称为吸收峰，它所对应的波长称为最大吸收波长，用入max表示。曲线的谷所 对应的波长称为最小吸收波长，用λm表示。峰旁一个小的曲折称为肩峰，在吸收曲线的 波长最短一端不成峰形的部分，称为末端吸收。吸收曲线有时也可用ε或1og作为纵坐标。 此外也可用百分透光度为纵坐标，但应用较少 图6一3绘出了不同浓度的“稀禾定”溶液的吸收曲线。从图中君出，同一物质即使浓 度改变，其吸收曲线形状及最大吸收波长不变，三种浓度的最大吸收波长均为283m。 浓度C 国6时不阳流点筑表位除降不)王一准世思：光华分折的收正自股生肉 吸收曲线的用涂 (1)吸收曲线的特征和形状是由分子的电子结构决定的，它反映了物质分子中能级的 变化情况： (2)它描述了物质对不同波长光的吸收能力，在定量分析中可作为选择最大吸收波长 的依据： (3)吸收曲线体现了物质的特性，不同物质具有不同特征的吸收曲线，因此可用作定 性鉴定的依据 (三)对比尔定律的偏离 根据比尔定律的原则，当吸收池厚度不变，以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过 原点的直线，但在实际工作中，吸光度与浓度之间的线性关系常常发生偏离，使曲线弯曲
曲线的峰称为吸收峰，它所对应的波长称为最大吸收波长，用λmax 表示。曲线的谷所 对应的波长称为最小吸收波长，用λmin 表示。峰旁一个小的曲折称为肩峰，在吸收曲线的 波长最短一端不成峰形的部分，称为末端吸收。吸收曲线有时也可用 e 或 loge 作为纵坐标。 此外也可用百分透光度为纵坐标，但应用较少。 图 6－3 绘出了不同浓度的“稀禾定”溶液的吸收曲线。从图中看出，同一物质即使浓 度改变，其吸收曲线形状及最大吸收波长不变，三种浓度的最大吸收波长均为 283nm。 吸收曲线的用途： （1）吸收曲线的特征和形状是由分子的电子结构决定的，它反映了物质分子中能级的 变化情况； （2）它描述了物质对不同波长光的吸收能力，在定量分析中可作为选择最大吸收波长 的依据； （3）吸收曲线体现了物质的特性，不同物质具有不同特征的吸收曲线，因此可用作定 性鉴定的依据。 （三）对比尔定律的偏离 根据比尔定律的原则，当吸收池厚度不变，以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过 原点的直线，但在实际工作中，吸光度与浓度之间的线性关系常常发生偏离，使曲线弯曲