匀；同法挑取少许细菌混入血清内，搅匀。将玻片略为摆动后静置室温中，1～3min后即可观察到一端有凝集反应出现，另一端为生理盐水对照，仍为均匀浑浊。微量滴定凝集法：在微量滴定板上标记10个孔，从1到10。用移液枪于第1孔中加0.08ml生理盐水，其余各加0.05ml。然后加0.02ml大肠杆菌抗血清于第1孔中。然后换一新的枪头，在第1孔中吸上，放下来回3次充分混匀，再吸0.05ml至第2孔。换枪头，同样在第2孔吸上，放下，3次后吸0.05ml至第3孔中，依次类推，一直稀释至第9孔，混匀后弃去0.05ml。每孔加大肠杆菌悬液0.05ml，将滴定板按水平方向摇动，以混合孔中内容物。然后将滴定板置湿盒内，35℃，1小时，再放冰箱过夜。最后观察孔底有无凝集现象。1.4.6制备血清小鼠颈动脉采血，采集的血液移入离心管中，尽量放成最大斜面，凝固后放入4-6℃冰箱中，使其自然析出血清。用已灭菌的毛细滴管洗出血清。若血清中带有红细胞，则用离心沉淀法去掉红细胞。然后将血清分装于灭菌细口瓶中。加入防腐剂，使血清含有0.01%硫柳汞。用蜡或胶带纸封瓶口，贴上标签，注明抗血清名称，凝集效价及日期，放冰箱备用。五、传代细胞培养与观察（一）步骤1、入无菌室之前用肥皂洗手，再用75%的酒精擦拭消毒双手；2、倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液37℃下预热。3、超净台台面应整洁，用75%酒精棉球擦拭清洁：4、打开超净工作台的紫外灯照射台面20min左右，关闭紫外灯，打开风机清洁空气出去臭氧；5、点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。6、将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7、倒掉培养细胞的旧培养基。情可用2-3mlHanks液洗去残留的就培养基，或用少量胰酶涮洗一下。8、每个大培养瓶加入1ml胰酶，小培养瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。9、加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10ml/大瓶；3-5ml/小瓶）制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖好瓶盖，适度拧紧后稍回转，以利于23
23 匀；同法挑取少许细菌混入血清内，搅匀。将玻片略为摆动后静置室温中，1～ 3min 后即可观察到一端有凝集反应出现，另一端为生理盐水对照，仍为均匀浑 浊。 微量滴定凝集法：在微量滴定板上标记 10 个孔，从 1 到 10。用移液枪于第 1 孔中加 0.08ml 生理盐水，其余各加 0.05ml。然后加 0.02ml 大肠杆菌抗血清于 第 1 孔中。然后换一新的枪头，在第 1 孔中吸上，放下来回 3 次充分混匀，再吸 0.05ml 至第 2 孔。换枪头，同样在第 2 孔吸上，放下，3 次后吸 0.05ml 至第 3 孔中，依次类推，一直稀释至第 9 孔，混匀后弃去 0.05ml。每孔加大肠杆菌悬 液 0.05ml，将滴定板按水平方向摇动，以混合孔中内容物。然后将滴定板置湿 盒内，35℃,1 小时，再放冰箱过夜。最后观察孔底有无凝集现象。 1.4.6 制备血清 小鼠颈动脉采血，采集的血液移入离心管中，尽量放成最大斜面，凝固后放 入 4-6℃冰箱中，使其自然析出血清。用已灭菌的毛细滴管洗出血清。若血清中 带有红细胞，则用离心沉淀法去掉红细胞。然后将血清分装于灭菌细口瓶中。加 入防腐剂，使血清含有 0.01%硫柳汞。用蜡或胶带纸封瓶口，贴上标签，注明抗 血清名称，凝集效价及日期，放冰箱备用。 五、传代细胞培养与观察 （一）步骤 1、入无菌室之前用肥皂洗手，再用 75% 的酒精擦拭消毒双手； 2、倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否传代及细胞需要稀释的倍数。 将 培养用液 37℃下预热。 3、超净台台面应整洁，用 75%酒精棉球擦拭清洁； 4、打开超净工作台的紫外灯照射台面 20min 左右，关闭紫外灯，打开风机清洁 空气出去臭氧； 5、点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精 灯火焰略烧后插在无菌试管内。 6、将培养用液瓶口用 75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7、倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用 2-3ml Hanks 液洗去残留的就培养基， 或用少量胰酶涮洗一下。 8、每个大培养瓶加入 1ml 胰酶，小培养瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜 下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶 倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。 9、加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散， 再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10ml/大瓶；3-5ml/小瓶） 制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖好瓶盖，适度拧紧后稍回转，以利于
CO2的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。10、对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。直接将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。(二)注意事项1、传代培养时注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。所有操作尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每种细胞使用一套器材。2、每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。3、如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BBS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗生素，并经常更换培养基。六、细胞的冻存与复苏（一）细胞冻存1、取待冻存的细胞用胰酶消化，用培养基将细胞冲洗下来。800r/min离心5min，弃上清收集细胞。如果是悬浮培养的细胞，可直接离心收集细胞。2、加入适量冻存液（10%甘油+90%培养基，或是10%DMS0+90%培养基）制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3*106个/m1左右，并可适量增加小牛血清浓度至20%。3、细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记（注明细胞种类、时间、条件等)。4、冻存管在4℃下存放30min，转放-20℃1.5h~2h，再转入-70℃4~12h后即可转入液氮内（-196℃），注意进行登记。（二）细胞复苏1、取一塘瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。2、从液氮中取出冻存管立即投入40℃水中迅速解冻。3、取出冻存管，用75%酒精清洁管口，打开。4、离心去上清收集细胞，用无血清培养基洗1次，加入3ml新鲜培养基，于小培养瓶中培养。5、每日观察细胞生长情况，如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长满后进行传代培养。（三）注意事项1、在使用含有DMSO的冻存液时，因为DMSO在室温状态易损伤细胞，所以在细胞加入冻存液后应尽快放入4℃环境中。2、准确记录细胞的种类、冻存时间、冻存液的品种和冻存者信息。七、生物制品无菌试验规程生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。各种生物制品的无菌试验除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。（一）抽样1.原液及半成品原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为0.1%，但不得少于1.Oml。24
24 CO2 的进入，将培养瓶放回 CO2 培养箱。 10、对悬浮培养细胞，步骤 7-9 不做。直接将细胞悬液进行离心去除旧培养基上 清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 (二)注意事项 1、传代培养时注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。所有操作尽量靠近酒精 灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每种细胞使用一套器材。 2、每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折 光性好，生长致密时即可传代。 3、如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必 须挽救，可加含有抗生素的 BBS 或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的 抗生素，并经常更换培养基。 六、细胞的冻存与复苏 （一）细胞冻存 1、取待冻存的细胞用胰酶消化，用培养基将细胞冲洗下来。800r/min 离心 5min， 弃上清收集细胞。如果是悬浮培养的细胞，可直接离心收集细胞。 2、加入适量冻存液（10%甘油+90%培养基，或是 10%DMSO+90%培养基）制成细胞 悬液。细胞浓度宜大，3*106 个/ml 左右，并可适量增加小牛血清浓度至 20%。 3、细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记（注明细胞种类、时间、条 件等）。 4、冻存管在 4℃下存放 30min，转放-20℃1.5h~2h，再转入-70℃4~12h 后即可 转入液氮内（-196℃），注意进行登记。 （二）细胞复苏 1、取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至 40℃左右。 2、从液氮中取出冻存管立即投入 40℃水中迅速解冻。 3、取出冻存管，用 75%酒精清洁管口，打开。 4、离心去上清收集细胞，用无血清培养基洗 1 次，加入 3ml 新鲜培养基，于小 培养瓶中培养。 5、每日观察细胞生长情况，如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长满后 进行传代培养。 （三）注意事项 1、在使用含有 DMSO 的冻存液时，因为 DMSO 在室温状态易损伤细胞，所以在细 胞加入冻存液后应尽快放入 4℃环境中。 2、准确记录细胞的种类、冻存时间、冻存液的品种和冻存者信息。 七、生物制品无菌试验规程 生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有活 的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无 菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。各种生物制品的无菌试验 除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。 （一）抽样 1.原液及半成品 原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为 0.1%，但不得少于 1.0ml
1.1大罐稀释的制品抽样数量不得少于10ml。1.2原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。2.成品每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过程的前、中、后样品）。2.1分装量在100支（瓶）或以下者抽检不少于5支，101～500支（瓶）者抽检不少于10支（瓶），501～10000支（瓶）者抽检不少于20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽检40支（瓶）。2.2每瓶装量20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶。6～20ml抽检量加倍。5ml和5ml以下者按1.2.1项抽检。2.3凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品可不再做。（二）无菌试验用培养基（培养基处方可附录1）1检查制品中本菌是否存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品时检查，有专门规定者除外）。2检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含量，做成斜面。3检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。4#生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。5无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210株）应达到10-8，短芽胞杆菌（7316株）和生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）应达到10-7，白色念珠菌（ATCc10231）和腊叶芽枝霉应达到10-。6生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵敏度试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵敏度试验法见附录2、3。7各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定所应定期抽检各所的无菌试验培养基。（三）无菌试验方法1无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进行，无菌操作室应经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。2菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品应用直接接种法进行无菌试验。人白蛋白及人内种球蛋白（包括各种剂型及应用途径的制品）应用薄膜过滤法进行无菌试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直接接种法进行。3直接接种法3.1菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品3.1.1每安装量5.0ml以上者（不含5.0ml）取样不应少于1.0ml，装量在5.0ml以下者（含5.0ml）取样不得少于0.5ml，装量不足0.5ml者，全部吸取。3.1.2含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1：50。先按此比例接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，于20～25℃培育3~4天后移种至硫乙醇25
25 1.1 大罐稀释的制品抽样数量不得少于 10ml。 1.2 原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。 2.成品 每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过程的前、 中、后样品）。 2.1 分装量在 100 支（瓶）或以下者抽检不少于 5 支，101～500 支（瓶）者抽检 不少于 10 支（瓶），501～10000 支（瓶）者抽检不少于 20 支（瓶，10001 支（瓶） 以上者抽检 40 支（瓶）。 2.2 每瓶装量 20ml 以上的冻干血液制品，每柜冻干 200 瓶以下者抽检 2 瓶，200 瓶及以上者抽检 4 瓶。6～20ml 抽检量加倍。5ml 和 5ml 以下者按 1.2.1 项抽检。 2.3 凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品可不 再做。 （二）无菌试验用培养基（培养基处方可附录 1） 1 检查制品中本菌是否存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品时检 查，有专门规定者除外）。 2 检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制 品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。 检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。 检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含 量，做成斜面。 3 检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。 4 生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。 5 无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210 株）应达到 10-8，短 芽胞杆菌（7316 株）和生孢子梭状芽胞杆菌（64941 株）应达到 10-7，白色念 珠菌（ATCc 10231）和腊叶芽枝霉应达到 10-6。 6 生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵敏度 试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵敏度试 验法见附录 2、3）。 7 各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定所应 定期抽检各所的无菌试验培养基。 （三）无菌试验方法 1 无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进行，无 菌操作室应经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。 2 菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品应用直接接 种法进行无菌试验。人白蛋白及人丙种球蛋白（包括各种剂型及应用途径的制品） 应用薄膜过滤法进行无菌试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直接接种法进 行。 3 直接接种法 3.1 菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品 3.1.1 每安瓿装量 5.0ml 以上者（不含 5.0ml）取样不应少于 1.0ml，装量在 5.0ml 以下者（含 5.0ml）取样不得少于 0.5ml，装量不足 0.5ml 者，全部吸取。 3.1.2 含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至 少为 1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为 1:50。先按此 比例接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，于 20～25℃培育 3～4 天后移种至硫乙醇
酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁培养基各2管，每管0.5ml。将硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面各1管置30～35℃培育，其余各管置20～25℃培育，培育时间除有专门规定者外共为8天。3.1.3不含防腐剂制品，装量在5.0ml以下者（包括5.0ml）每10支安混合，装量在5.0ml以上者每7支安混合，将混合后的样品直接接种一组培养基，分别置20～25℃、30～35℃培育，培育时间共为8天。3.1.4支原体培养基临用时将半固体煮沸10~15分钟后，冷却到56℃左右，加入未灭能马血清或灭能小牛血清和酵母浸液（培养基、血清、酵母浸液之比为7:2：1），并可酌情加入适量青霉素或醋酸铠，充分摇匀，等冷至35～37℃时种入待检样品0.5～1.0ml，共接种2支培养基，置35～37℃培育14天。3.1.5混浊和接种后不能判定结果的制品，可取规定量的样品接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，3～4天后移种。培养基种类和支数、培育温度同3.3.1.2项，共培育8天后判定结果。3.2血液制品3.2.1取规定抽样数，按下列规定，从每瓶抽取样品，并全部接种完。样品每瓶装量不足1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取1.0ml以上，每支装量为15ml的培养基，接种1.0ml。3.2.1样品每瓶装量以下者（不含）抽取5.0ml以上，100ml及以上者按15%抽样，每支装量为40ml的培养基，接种5.0ml。应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马丁培养基支数之比为2:1。接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的1/2置30～35℃培育，其余置20～25℃培育，改良马丁培养基置20～25℃培育，培育时间不少于14天。4薄膜过滤法滤膜孔径为0.22~0.3m。取规定抽检样品数，每瓶装量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上者取半量加入灭菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。如为含汞防腐剂者，在样品过滤后，应用灭菌生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。过滤后，无菌取出滤膜，分别放入硫乙醇酸盐培养基2支及改良马丁培养基1支（每支装量不少于40ml，高度不得低于7cm）。如果使用一个过滤装置，则将该膜剪成三等分，分别放入规定培养基中。将滤膜放入培养基后，一支硫乙醇酸盐培养基置30～35℃培育，其余各支培养基置20～25℃培育。培育时间不少于7天。最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器，要求每支培养器培养装量为100ml。5检查厌氧性杂菌用培养基需加热驱氧者，必须冷却到45℃以下再行接种。6冻干制品按使用说明书或瓶签规定的稀释量稀释后进行无菌试验。（四）判定1无杂菌生长判为合格（有专门规定者除外）。2无菌试验发现杂菌生长，可复试。该制品量应加倍。若复试仍有同样杂菌生长，该制品判为不合格。如为不同杂菌生长，可第二次复试，复试样品为第一次复试量的2倍，若仍有杂菌生长该制品判为不合格。支原体阳性者不复试，该抵制品判为不合格。3成品无菌试验不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量检定部门会同有关部门根据具体情况，全部或部分废弃。26
26 酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁培养基各 2 管，每管 0.5ml。将硫乙醇 酸盐培养基、适宜的琼脂斜面各 1 管置 30～35℃培育，其余各管置 20～25℃培 育，培育时间除有专门规定者外共为 8 天。 3.1.3 不含防腐剂制品，装量在 5.0ml 以下者（包括 5.0ml）每 10 支安瓿混合， 装量在 5.0ml 以上者每 7 支安瓿混合，将混合后的样品直接接种一组培养基，分 别置 20～25℃、30～35℃培育，培育时间共为 8 天。 3.1.4 支原体培养基临用时将半固体煮沸 10～15 分钟后，冷却到 56℃左右， 加入未灭能马血清或灭能小牛血清和酵母浸液（培养基、血清、酵母浸液之比为 7:2:1），并可酌情加入适量青霉素或醋酸铊，充分摇匀，等冷至 35～37℃时种 入待检样品 0.5～1.0ml，共接种 2 支培养基，置 35～37℃培育 14 天。 3.1.5 混浊和接种后不能判定结果的制品，可取规定量的样品接种于不含琼脂 的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，3～4 天后移种。培养基种类和 支数、培育温度同 3.3.1.2 项，共培育 8 天后判定结果。 3.2 血液制品 3.2.1 取规定抽样数，按下列规定，从每瓶抽取样品，并全部接种完。 样品每瓶装量不足 1.0ml 者，抽取全量，1～20ml 以下者（不含 20ml），抽取 1.0ml 以上，每支装量为 15ml 的培养基，接种 1.0ml。 3.2.1 样品每瓶装量以下者（不含）抽取 5.0ml 以上,100ml 及以上者按 15%抽 样，每支装量为 40ml 的培养基，接种 5.0ml。 应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马丁培养 基支数之比为 2:1。 接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的 1/2 置 30～35℃培育，其余置 20～25℃培 育，改良马丁培养基置 20～25℃培育，培育时间不少于 14 天。 4 薄膜过滤法 滤膜孔径为 0.22～0.3μm。 取规定抽检样品数，每瓶装量 100ml 及 100ml 以下者取全量，100ml 以上者取半 量加入灭菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。如为含汞防腐剂者，在样品过滤后， 应用灭菌生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜 3 次，每次 100ml。过滤后，无菌取 出滤膜，分别放入硫乙醇酸盐培养基 2 支及改良马丁培养基 1 支（每支装量不少 于 40ml，高度不得低于 7cm）。如果使用一个过滤装置，则将该膜剪成三等分， 分别放入规定培养基中。将滤膜放入培养基后，一支硫乙醇酸盐培养基置 30～ 35℃培育，其余各支培养基置 20～25℃培育。培育时间不少于 7 天。 最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器，要求每支培养器培养装量为 100ml。 5 检查厌氧性杂菌用培养基需加热驱氧者，必须冷却到 45℃以下再行接种。 6 冻干制品按使用说明书或瓶签规定的稀释量稀释后进行无菌试验。 （四）判定 1 无杂菌生长判为合格（有专门规定者除外）。 2 无菌试验发现杂菌生长，可复试。该制品量应加倍。若复试仍有同样杂菌生 长，该制品判为不合格。如为不同杂菌生长，可第二次复试，复试样品为第一次 复试量的 2 倍，若仍有杂菌生长该制品判为不合格。支原体阳性者不复试，该批 制品判为不合格。 3 成品无菌试验不合格的亚批数占整批的 30%以上时，由质量检定部门会同有 关部门根据具体情况，全部或部分废弃
附录1无菌试验培养基处方1硫乙醇酸盐培养基15g胰酪蛋白陈（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）5g酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）葡萄糖5g氯化钠2.5g0.5gL-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）0.5g琼脂0.65~0.75g新鲜配制的0.1%刃天青溶液（或0.2%美蓝溶液0.5ml）1.0ml去离子水（或蒸馏水）加至1000ml最后pH7.1±0.22硫乙醇酸盐培养基（不含琼脂）胰酪蛋白陈（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）15g5g酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）葡萄糖5g氯化钠2.5g0.5gL-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）0.5g加至1000ml去离子水（或蒸馏水）最后pH7.1±0.23改良马丁培养基葡萄糖20g5g蛋白陈酵母浸出粉（或酵母透析液100ml）2g磷酸氢二钾1g硫酸镁（含7分子结晶水）0. 5g去离子水（或蒸馏水）加至1000ml最后pH6.4±0.24猪胃消化液半固体培养基猪胃消化液500ml1:2牛肉浸液500ml氯化钠2.5g葡萄糖1g琼脂3~4g牛心消化液1000ml27
27 附录 1 无菌试验培养基处方 1 硫乙醇酸盐培养基 胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计 2000mg） 15g 酵母浸出粉（或酵母透析液 200ml） 5g 葡萄糖 5g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐） 0.5g 硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸 0.6ml） 0.5g 琼脂 0.65～0.75g 新鲜配制的 0.1%刃天青溶液（或 0.2%美蓝溶液 0.5ml） 1.0ml 去离子水（或蒸馏水） 加至 1000ml 最后 pH7.1±0.2 2 硫乙醇酸盐培养基（不含琼脂） 胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计 2000mg） 15g 酵母浸出粉（或酵母透析液 200ml） 5g 葡萄糖 5g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐） 0.5g 硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸 0.6ml） 0.5g 去离子水（或蒸馏水） 加至 1000ml 最后 pH7.1±0.2 3 改良马丁培养基 葡萄糖 20g 蛋白胨 5g 酵母浸出粉（或酵母透析液 100ml） 2g 磷酸氢二钾 1g 硫酸镁（含 7 分子结晶水） 0.5g 去离子水（或蒸馏水） 加至 1000ml 最后 pH6.4±0.2 4 猪胃消化液 半固体培养基 猪胃消化液 500ml 1:2 牛肉浸液 500ml 氯化钠 2.5g 葡萄糖 1g 琼脂 3～4g 牛心消化液 1000ml