酵母浸膏1g琼脂3~4g附录2需-厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法1菌种1.1需氧菌乙型溶血性链球菌（32210株），短芽胞杆菌（7316株）。1.2厌氧菌生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）。以上菌株均由中国药品生物制品检定所分发。2培养基凡应用于无菌试验的培养基（增菌和试验用）都应进行灵敏度试验。3操作3.1不应在同一无菌操作室内同时操作2个菌株。3.2将菌种接种于适宜的培养基，经30～35℃培育一定时间（乙型溶血性链球菌和生孢子梭状芽胞杆菌培育24～48小时，短芽胞杆菌培育18～20小时）后，将乙型溶血性链球菌和短芽胞杆菌分别刮入灭菌的生理盐水内制成均匀菌液，生子孢梭状芽胞杆菌先将菌液吸入灭菌的试管内，再用灭菌生理盐水稀释适宜浓度制成均匀菌液，再将菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度。然后用0.1%蛋白陈水作10倍系列稀释。3.3将10~10-°（短芽胞杆菌、生子孢梭状芽胞杆菌为10~10，乙型溶血性链球菌为10～10）菌液各1ml分别接种到9ml（用于厌氧菌的培养基在试管中装置高度不得低于7cm）试验用培养基中，每个稀释度至少接种3管，并用未接种的培养基做对照，将接种乙型溶血性链球菌、生子孢梭状芽胞杆菌的培养基，置30～35℃培育3天，接种短芽胞杆菌的培养基培育5天，记录结果。4结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，3次试验中，以2次达到的最高灵敏度为判定标准。附录3霉菌无菌试验培养基灵敏度试验法1菌种白色念珠菌、腊叶芽枝霉，由中国药品生物制品检定所分发。2培养基凡应用于霉菌无菌试验用的培养基都应进行灵敏度试验。3操作3.1操作霉菌的无菌室应与其他无菌室隔离，有2个以上菌株试验时，不应在同一无菌操作室内同时进行。3.2将菌接种在土豆培养基上，20～25℃培养5～7天后用灭菌生理盐水洗下菌苔，移入装有玻璃珠的大管中将孢子打散，经装有脱脂棉注射器过滤。将菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度，然后做10倍系列稀释。3.3将10-5~10-7菌液各1ml分别接种到9ml试验培养基中，每个稀释度至少接种3管并用未接种过的培养基作对照，20～25℃培育5天，逐日观察结果。八、支原体检验法（一）培养基1检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗，用改良Frey氏培养基。28
28 酵母浸膏 1g 琼脂 3～4g 附录 2 需-厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法 1 菌种 1.1 需氧菌 乙型溶血性链球菌（32210 株），短芽胞杆菌（7316 株）。 1.2 厌氧菌 生孢子梭状芽胞杆菌（64941 株）。 以上菌株均由中国药品生物制品检定所分发。 2 培养基 凡应用于无菌试验的培养基（增菌和试验用）都应进行灵敏度试验。 3 操作 3.1 不应在同一无菌操作室内同时操作 2 个菌株。 3.2 将菌种接种于适宜的培养基，经 30～35℃培育一定时间（乙型溶血性链球 菌和生孢子梭状芽胞杆菌培育 24～48 小时，短芽胞杆菌培育 18～20 小时）后， 将乙型溶血性链球菌和短芽胞杆菌分别刮入灭菌的生理盐水内制成均匀菌液，生 子孢梭状芽胞杆菌先将菌液吸入灭菌的试管内，再用灭菌生理盐水稀释适宜浓度 制成均匀菌液，再将菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度。然后用 0.1%蛋白胨 水作 10 倍系列稀释。 3.3 将 10-6～10-8（短芽胞杆菌、生子孢梭状芽胞杆菌为 10-6～10-8，乙型溶血性 链球菌为 10-7～10-9）菌液各 1ml 分别接种到 9ml（用于厌氧菌的培养基在试管中 装置高度不得低于 7cm）试验用培养基中，每个稀释度至少接种 3 管，并用未接 种的培养基做对照，将接种乙型溶血性链球菌、生子孢梭状芽胞杆菌的培养基， 置 30～35℃培育 3 天，接种短芽胞杆菌的培养基培育 5 天，记录结果。 4 结果判定 以接种后培养基管数的 2/3 以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，3 次试验中，以 2 次达到的最高灵敏度为判定标准。 附录 3 霉菌无菌试验培养基灵敏度试验法 1 菌种 白色念珠菌、腊叶芽枝霉，由中国药品生物制品检定所分发。 2 培养基 凡应用于霉菌无菌试验用的培养基都应进行灵敏度试验。 3 操作 3.1 操作霉菌的无菌室应与其他无菌室隔离，有 2 个以上菌株试验时，不应在 同一无菌操作室内同时进行。 3.2 将菌接种在土豆培养基上，20～25℃培养 5～7 天后用灭菌生理盐水洗下菌 苔，移入装有玻璃珠的大管中将孢子打散，经装有脱脂棉注射器过滤。将菌液稀 释至与标准比浊管相同之浓度，然后做 10 倍系列稀释。 3.3 将 10-5～10-7 菌液各 1ml 分别接种到 9ml 试验培养基中，每个稀释度至少 接种 3 管并用未接种过的培养基作对照，20～25℃培育 5 天，逐日观察结果。 八、支原体检验法 （一）培养基 1 检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗，用改良 Frey 氏培养基
2检验其他种类细胞和病毒活疫苗，用支原体培养基3检验血清用无血清的支原体培养基（二）检查法1样品处理每批制品取样3-5瓶，液体制品混合后备用：冻干制品加液体培养基复原成混悬液后混合。检测血清时用血清直接接种。2疫苗的检测2.1接种于观察每个样品需同时用以下两种方法检测2.1.1液体培养基培养将疫苗混合物5.0m1接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中去0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置于37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取出0.2m1培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察后14日后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任一小管内液体颜色出现明显变化，在原pH变化达0.5时，应立即移植于液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。2.1.2琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2m1接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳。潮湿的环境、37℃下培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原pH变化达到0.5时，也同时接种琼脂平板。每5-7日，在低倍显微镜下观察各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落时，停止观察。2.1.3对照每次检查需同时设置阳性、阴性对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照3血清的检测取本血清50ml代替培养基中的马、猪血清，按附录38页培养基配方配成大瓶培养，按2.2.1.2项稀释、移植、培养，观察小管培养基的pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。29
29 2 检验其他种类细胞和病毒活疫苗，用支原体培养基 3 检验血清 用无血清的支原体培养基 （二）检查法 1 样品处理 每批制品取样 3-5 瓶，液体制品混合后备用；冻干制品加液体培养 基复原成混悬液后混合。检测血清时用血清直接接种。 2 疫苗的检测 2.1 接种于观察 每个样品需同时用以下两种方法检测 2.1.1 液体培养基培养 将疫苗混合物 5.0ml 接种小瓶液体培养基中，再从小瓶 中去 0.2ml 移植接种于 1 小管液体培养基中，将小瓶与小管置于 37℃培养，分 别于接种后 5 日、10 日、15 日从培养瓶中取出 0.2ml 培养物移植到小管液体培 养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植 小管培养、观察后 14 日后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任一小管内 液体颜色出现明显变化，在原 pH 变化达 0.5 时，应立即移植于液体培养基和固 体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的 pH 变化，及固体上有无典型的 “煎蛋”状支原体菌落。 2.1.2 琼脂固体平板培养 在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物 0.1-0.2ml 接种于琼脂平板，置含 5%-10%二氧化碳。潮湿的环境、37℃下培养。 此外，在液体培养基颜色出现变化，在原 pH 变化达到 0.5 时，也同时接种琼脂 平板。每 5-7 日，在低倍显微镜下观察各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经 14 日观察，仍无菌落时，停止观察。 2.1.3 对照 每次检查需同时设置阳性、阴性对照，在同条件下培养观察。检测 禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。 3 血清的检测 取本血清 50ml 代替培养基中的马、猪血清，按附录 38 页培养基 配方配成大瓶培养，按 2.2.1.2 项稀释、移植、培养，观察小管培养基的 pH 变 化情况和琼脂平板上有无菌落
第五章抗生素生产实习内容一、实验目的1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论4、了解小型发酵罐的结构及发酵过程中的流体流动形式5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养6、掌握抗生素生物效价测定的原理和方法7、掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法8、掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基本原理和操作技术二、实验原理抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。工业上生产抗生素主要以发酵罐发酵生产。发酵罐是进行液体发酵的特殊设备，生产上使用的容积大，均用钢板或不锈钢板制成。在实验室使用的容积相对较小，称为小型发酵罐，或实验罐。其容积可从约IL至数百升或几吨。一般来说，5L以下是用耐压钢化玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。抗生素发酵经过一定的发酵工艺（温度、pH值、溶氧、泡沫、补料、营养基质浓度等）控制，到达发酵周期后终止发酵，进行次级代谢物的提取。不同的微生物产生的次级代谢产物不同，积累的位置也不同，有些产物处于胞内，有些处于胞外。根据不同的目的设计不同的提取方案。对于人用的抗生素来说，提取抗生素的方法，通常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，根据次级产物的理化性质设计提取工艺。对于次级代谢产物效价的初步测定通产可采用释放次级代谢产物后直接进行抑菌实验，称为抑菌圈法或生物效价测30
30 第五章 抗生素生产实习内容 一、实验目的 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法 3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论 4、了解小型发酵罐的结构及发酵过程中的流体流动形式 5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养 6、掌握抗生素生物效价测定的原理和方法 7、掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法 8、掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基本原理和操作技术 二、实验原理 抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动 植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干 扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌 培 养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。工业上生产抗生素主要 以发酵罐发酵生产。发酵罐是进行液体发酵的特殊设备，生产上使用的容积大， 均用钢板或不锈钢板制成。在实验室使用的容积相对较小，称为小型发酵罐，或 实验罐。其容积可从约 lL 至数百升或几吨。一般来说，5L 以下是用耐压钢化玻 璃制作罐体，5L 以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种 电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工 业等科学研究所必需的设备。 抗生素发酵经过一定的发酵工艺（温度、pH 值、溶氧、泡沫、补料、营养 基质浓度等）控制，到达发酵周期后终止发酵，进行次级代谢物的提取。不同的 微生物产生的次级代谢产物不同，积累的位置也不同，有些产物处于胞内，有些 处于胞外。根据不同的目的设计不同的提取方案。对于人用的抗生素来说，提取 抗生素的方法，通常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢 物，根据次级产物的理化性质设计提取工艺。对于次级代谢产物效价的初步测定 通产可采用释放次级代谢产物后直接进行抑菌实验，称为抑菌圈法或生物效价测
定法。抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.1mm，外径8.0±0.1mm，高10±0.lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。(式 1)（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）V= (UH+UL) - (SH+SL)(式 2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径：UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径：(2）求出：=D-antilog(IV/W)(式 3)式中：：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。31
31 定法。 抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物 具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素 效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平 板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测 定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放 置小钢管（内径 6.0±0.l mm，外径 8.0±0.l mm，高 10±0. lmm），管内放人标准品 和检品的溶液，经 16~18 小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形 成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当 抗生素浓度达到或高于 MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖， 从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导， 抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品 的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。 常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。 二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1 或 4:1）的两种 溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直 线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放 置 4 个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测 量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。 （1）求出 W 和 V： W=（SH+UH）-（SL+UL） (式 1) V=（UH+UL）-（SH+SL） (式 2) 式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径； UL：供试品低剂量之抑菌圈直径； SH：标准品高剂量之抑菌圈直径； SL：标准品低剂量之抑菌圈直径； （2）求出 θ： θ=D·antilog（IV/W） (式 3) 式中：θ：供试品和标准品的效价比； D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为 1； I：高低剂量之比的对数，即 log2 或 log4
（3）求出Pr：Pr=Arxe(式4)式中：Pr：供试品实际单位数：Ar：供试品标示量或估计单位三、土霉素生产工艺举例1土霉素概述土霉素又称为地霉素或氧四环素，英文名称（TerramycinOxytetracycline)属于抗菌素的一种，对多种球菌和杆菌有抗菌作用，对立克次体和阿米巴病原虫也有抑制作用，用来治疗上呼吸道感染、胃肠道感染、斑疹伤寒等，现今主要用于畜禽药及饲料添加剂。土霉素是一个典型的利用生物工程技术生产的产品，生产工艺涉及种子培养、发酵、提取、过滤、脱色、结晶、离心和干燥等重要的单元操作和工程概念。1.1土霉素简介1.1.1名称与化学结构式中文名：土霉素英文名：oxYtetracycline化学名：（4s，4aR，5S，5aR，6S，12aS）-N-4-二甲胺基-1，4，4a，5，5a，6，11，12a-八氢，5，6，10，12，12a-六羟基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺。OOHori1NHOHHHCN-CH,OHHCH,图5-1土霉素结构分子式：C22H24N209相对分子质量：460.581.1.2性状与理化性质土霉素又名氧四环素，为灰白色至黄色的结晶粉末，无臭，味苦，熔点是180℃，在日光下颜色变暗在碱性溶液中易破坏失效。土霉素盐酸盐为黄色结晶，味苦，熔点190～194℃，有吸湿性，但水分和光线不影响其效价，在室温下长期保存不变质，不失效。盐酸盐易溶于水，溶于甲醇，微溶于无水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性条件下不稳定。添加到饲料中，在室温下保存四个月，效价下降4%9%，制粒时效价下降5%~7%。1.2土霉素生产菌种土霉素是由放线菌（龟裂链霉菌）所产生的抗生素。土霉素钙盐是发酵培养液中入碳酸钙，经过滤，干燥而制得。32
32 （3）求出 Pr ：Pr = Ar×θ (式 4) 式中：Pr：供试品实际单位数；Ar：供试品标示量或估计单位 。 三、土霉素生产工艺举例 1 土霉素概述 土霉素又称为地霉素或氧四环素，英文名称（Terramycin Oxytetracycline)属于抗菌素的 一种，对多种球菌和杆菌有抗菌作用，对立克次体和阿米巴病原虫也有抑制作用，用来治疗 上呼吸道感染﹑胃肠道感染﹑斑疹伤寒等，现今主要用于畜禽药及饲料添加剂。土霉素是一 个典型的利用生物工程技术生产的产品，生产工艺涉及种子培养、发酵、提取、过滤、脱色、 结晶、离心和干燥等重要的单元操作和工程概念。 1.1 土霉素简介 1.1.1 名称与化学结构式 中文名：土霉素 英文名：OXYtetracycline 化学名：(4s,4аR，5S，5аR，6S，12аS）-N-4-二甲胺基-1，4，4а，5，5а， 6，11，12а-八氢，5, 6，10，12，12а- 六羟基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2- 甲酰胺。 图 5-1 土霉素结构 分子式：C22H24N2O9 相对分子质量：460.58 1.1.2 性状与理化性质 土霉素又名氧四环素，为灰白色至黄色的结晶粉末，无臭，味苦，熔点是 180℃，在日光下颜色变暗在碱性溶液中 易破坏失效。土霉素盐酸盐为黄色结晶， 味苦，熔点 190～194℃，有吸湿性，但水分和光线不影响其效价，在室温下长 期保存不变质，不失效。盐酸盐易溶于水，溶于甲醇，微溶于无水乙醇，不溶于 三氯甲烷和乙醚，在酸性条件下不稳定。添加到饲料中，在室温下保存四个月， 效价下降 4%～9%，制粒时效价下降 5%～7%。 1.2 土霉素生产菌种 土霉素是由放线菌（龟裂链霉菌）所产生的抗生素。土霉素钙盐是发酵培养 液中入碳酸钙，经过滤，干燥而制得