保温90～120min。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5～8h。（4）湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器血、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks液、PBS、20xSSC等）。手动高压灭菌锅操作如下：①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。②加热高压锅。将放气阀打开，放气5～10min，以排除锅内的冷空气。③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器血等用15磅（121℃）30min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅（115℃）20min。调节火力大小保持该压力。④停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。如：电热自动灭菌锅使用说明（型号：SANYOAutoclaveMLS-3020）：①放气筒加水至LOW水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后将放气筒归于原位。②打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于V型凹槽的1/3~2/3处。③打开电源。④设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为105121℃，高压灭菌一般采用121℃20~30min。③把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将exhaust钮旋至close位置。③关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。③按start钮，开始高压，在温度达80时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。当压力降至OMPa时，蜂鸣器再报警一声。温度降至80℃时，蜂鸣器报警10次。显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。③关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。（5）滤过除菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器（直径90mm、100mm、142mm等），配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径20mm、25mm等）。滤膜孔径有0.60μm、0.45μm、0.35um、0.22μm、0.10μm等，以0.22μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0.22μm。②用布包好，湿热灭菌后使用。2.化学消毒法常用的消毒液有如下几种：（1）70%（或75%）酒精：超净台里常备70%酒精棉球（卫生级酒精），用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。（2）0.1%新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。（3）来苏儿水（煤酚皂溶液）：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，18
18 保温 90～120min。用于 RNA 提取实验的用品则需 180℃，保温 5～8 h。 （4）湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、 橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉 淀的无机溶液（如 Hanks 液、PBS、20x SSC 等）。手动高压灭菌锅操作如下： ① 首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。 ② 加热高压锅。将放气阀打开，放气 5～10min，以排除锅内的冷空气。 ③ 待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用 15 磅（121℃） 30min，胶塞、塑料制品、溶液等可用 10 磅（115℃）20min。调节火力大小保持 该压力。 ④ 停止加热，待压力自然下降至 0 再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的 物品烘干。 如：电热自动灭菌锅使用说明（型号：SANYO Autoclave MLS-3020）： ① 放气筒加水至 LOW 水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后 将放气筒归于原位。 ② 打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于 V 型凹槽的 1/3～2/3 处。 ③ 打开电源。 ④ 设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为 105～121℃，高压灭菌一般采用 121℃ 20～30 min。 ⑤ 把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将 exhaust 钮旋至 close 位置。 ⑥ 关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。 ⑦ 按 start 钮，开始高压，在温度达 80℃时显示器开始显示温度，当温度达到 所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结 束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。当压力降至 0MPa 时，蜂鸣器再报警一声。 温度降至 80℃时，蜂鸣器报警 10 次。显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。 ⑧ 关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。 （5）滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤 器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。 如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器（直径 90mm、100mm、142mm. 等），配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径 20mm、25mm 等）。滤膜孔径有 0.60μm、0.45μm、0.35μm、0.22μm、0.10μm 等，以 0.22μm 除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大 的滤膜。 ① 在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为 0.22μm。 ② 用布包好，湿热灭菌后使用。 2．化学消毒法 常用的消毒液有如下几种： （1）70%（或 75%）酒精：超净台里常备 70%酒精棉球（卫生级酒精），用于手和 一些金属器械或工作台面的消毒。 （2）0.1%新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超 净台旁应常备盛有 0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。 （3）来苏儿水（煤酚皂溶液）：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗
以及空气喷酒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。（4）0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷酒和擦拭方式进行。（5）乳酸蒸气：将乳酸放人锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1～3d。可将空气中漂浮的微生物杀死。（6）37%甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸汽。1～3d后方可达到消毒空气的目的。3.煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。（三）注意事项1.清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10～15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。干万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。2.干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器血烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。3高压灭菌后器血务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。4：牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压（如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等）。5.滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜（有时可在上面加一层定性滤纸），包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要行得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压火菌之后，再行紧使用。6.使用化学消毒法时，配制75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸汽对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。二、PBS和消化液(胰酶液)的配制（一）配制D-Hanks液1.按表1-3称取D-Hanks试剂。表4-2Hanks，D-Hanks液（g/L）的成分比较成分HanksD-HanksCaC12（无水）0. 14-KC10. 40. 40.06KH,PO40.06MgC12·6H200.10MgS04:7H200.10一NaC18.08. 00.350.35NaHCOs19
19 以及空气喷洒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。 （4）0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10min 即可将芽孢菌杀死。用于各种物品 的表面消毒，用喷洒和擦拭方式进行。 （5）乳酸蒸气：将乳酸放人坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧 闭 1～3d。可将空气中漂浮的微生物杀死。 （6）37%甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将 37%甲醛用酒精灯或电炉加热 至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛 中形成蒸汽。1～3d 后方可达到消毒空气的目的。 3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸 15min 后使用。 （三）注意事项 1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗 10～15 次。因为残存的洗液 对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用 硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip 和 Tube 一定要用超声清洗处 理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。 2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过 100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至 100℃之下才能开烤箱 门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。 3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。 4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压（如 TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS 等)。 5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜（有时可在上面加一层定性滤纸），包 好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。 过滤时压力不宜过大，压力数字以 2 为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使 某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要 拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。 6．使用化学消毒法时，配制 75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优 质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有 的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后 放出的蒸汽对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。 二、PBS 和消化液(胰酶液)的配制 （一）配制 D-Hanks 液 1．按表 1-3 称取 D-Hanks 试剂。 表 4-2 Hanks，D-Hanks 液（g/L）的成分比较 成 分 Hanks D-Hanks CaCl2（无水） 0.14 — KCl 0.4 0.4 KH2PO4 0.06 0.06 MgCl2·6H2O 0.10 — MgSO4·7H2O 0.10 — NaCl 8.0 8.0 NaHCO3 0.35 0.35
Na2HPO,·12H200.1320.09Na2HPO,·7H201.0D-葡萄糖1.0（根据需要加或不加）ImL酚红（2%）1mL2.依次加入上述试剂至800mL蒸馏水中，溶解后定容至1000mL。3.高压灭菌，10磅10min。配制Hanks液1.按表1-2称取Hanks试剂。2.配制Hanks时，需将CaCl2另溶解于100mL的蒸馏水中。3.依次加入上述试剂至700mL蒸溜水中，溶解后再与CaC12溶液一起定容至1000mL.4.10磅，10min高压灭菌。配制胰蛋白酶消化液1.D-Hanks液高压灭菌之后，晾至室温，4℃保存备用。2.称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中（夏天时研磨器应放在冰浴中），加入少量D-Hanks液研磨1000次左右，调制成糊状。再放人4℃预冷的适量D-Hanks液中，4℃下磁力搅拌使完全溶解。3用NaHCO3干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右（胰酶作用的最适pH值），并加入0.02%EDTA以协助消化作用。4：滤过除菌（方法见二、培养基的配制），-20℃冻存。（二）注意事项1.BSS的pH值应确定为7.2左右。2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100mL的CaC12与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免高压灭菌后液体变混。3.胰酶受热易失活，所以尽量避免盛夏配制，并且在配制过程中温度应始终保持在4℃左右。4：胰酶研磨要充分，否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉，不能达到真正的浓度。5．胰酶分装时尽量分装成小瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时体积会膨胀，而多次使用同一瓶胰酶可能增加污染的机会。尽量缩短胰酶在0℃以上停留的时间，以保持胰酶的消化能力。三、培养基的配制（一）准备和安装过滤器清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μpm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20min进行高压灭菌处理。在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接人滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管伸人到已消毒好的瓶子中。用滤泵做正压过滤，压力数字为2。过滤后要检查滤膜是否完好无损。（二）合成培养基的配制1.去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏（去除无机和有机杂质），制3000mL三蒸水。三蒸水应及时使用，如果放置一段时间，则使用前须高压处理（15磅20min）。20
20 Na2HPO4·12H2O — 0.132 Na2HPO4·7H2O 0.09 — D-葡萄糖 1.0 1.0（根据需要加或不加） 酚红（2%） 1mL 1mL 2．依次加入上述试剂至 800mL 蒸馏水中，溶解后定容至 1000mL。 3．高压灭菌，10 磅 10min。 配制 Hanks 液 1．按表 1-2 称取 Hanks 试剂。 2．配制 Hanks 时，需将 CaCl2另溶解于 100mL 的蒸馏水中。 3．依次加入上述试剂至 700mL 蒸溜水中，溶解后再与 CaCl2 溶液一起定容至 1000mL。 4．10 磅，10min 高压灭菌。 配制胰蛋白酶消化液 1．D-Hanks 液高压灭菌之后，晾至室温，4℃保存备用。 2．称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中（夏天时研磨器应放在冰浴中），加入少 量 D-Hanks 液研磨 1000 次左右，调制成糊状。再放人 4℃预冷的适量 D-Hanks 液中，4℃下磁力搅拌使完全溶解。 3．用 NaHCO3干粉将胰酶溶液的 pH 值调至 8.0 左右（胰酶作用的最适 pH 值）， 并加入 0.02%EDTA 以协助消化作用。 4．滤过除菌（方法见二、培养基的配制），-20℃冻存。 （二）注意事项 1．BSS 的 pH 值应确定为 7.2 左右。 2．如配制的 Hanks 液高压灭菌后液体变混，则可将 100mL 的 CaCl2与含有其他 成分的液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免 高压灭菌后液体变混。 3．胰酶受热易失活，所以尽量避免盛夏配制，并且在配制过程中温度应始终保 持在 4℃左右。 4．胰酶研磨要充分，否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉，不能达到真正的浓 度。 5．胰酶分装时尽量分装成小瓶，并遵守 3 次左右用完和只装 2/3 体积的原则。 因为冷冻保存时体积会膨胀，而多次使用同一瓶胰酶可能增加污染的机会。尽量 缩短胰酶在 0℃以上停留的时间，以保持胰酶的消化能力。 三、培养基的配制 （一）准备和安装过滤器 清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径 0.22μpm 的微孔滤膜，用布包装好， 15 磅 20min 进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接人滤泵再插入待除菌的液体中，出口端 胶管伸人到已消毒好的瓶子中。用滤泵做正压过滤，压力数字为 2。 过滤后要检查滤膜是否完好无损。 （二）合成培养基的配制 1．去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏（去除无机和有机杂质），制 3000mL 三蒸水。 三蒸水应及时使用，如果放置一段时间，则使用前须高压处理（15 磅 20min）
2.待水温降至15～30℃，加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间（2～4h）使之充分溶解。3.配制RPMI164O培养基时应通人适量CO,或加入6mo1/L盐酸调pH至6.0左右，这样才能充分溶解。4.加入一定量NaHCO，调节pH至7.0左右。5.加水至最终体积。6.在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250mL或500mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。7.瓶口封好，4℃冰箱贮存（RPMI1640培养基可以-20℃贮存）。（三）小牛血清的处理市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体（近来也有观点认为热灭活处理是不必要的）。1.将血清加热至56℃并保持30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。2.处理后的血清贮存于4℃。3.小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量（见八、新生牛血清的筛选）。（四）生长培养基的配制除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清和抗菌素。1.培养基分装成小瓶（100～200mL）以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。2.按如下比例配制：基本培养基占80%～90%，小牛血清占10%~20%。按1%体积分数加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。（五）注意事项1.培养细胞使用的瓶子和饭盒应与提取RNA和培养细菌的瓶子和饭盒严格分开。因为用于处理提取RNA的DEPC水（0.1%焦炭酸二乙酯）是一种致癌剂，并可能影响细胞生长；而培养过细菌的用品也不应与细胞混用。2.过滤时压力不要太大，以压力数字2为宜，否则细菌易滤过达不到除菌效果，或使滤膜破裂。分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中（分装量为使用3～5次用完为宜，并且每瓶只能装2/3体积的液体，过多时瓶子易爆或胶塞自喷）。3.滤器用毕立即刷洗，过蒸馏水，晾干收藏。四、抗原与免疫血清的制备（一）血细胞抗原的制备采取免子静脉血0.2ml，用肝素抗凝。低速离心，收集血细胞，用0.9%NaC1调整细胞浓度至4×10°个/ml。（二）大肠杆菌抗原的制备吸取灭菌的0.5%石碳酸生理盐水5ml，注入大肠杆菌斜面培养物上，将菌苔21
21 2．待水温降至 15～30℃，加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间（2～4h） 使之充分溶解。 3．配制 RPMIl640 培养基时应通人适量 CO2或加入 6mol/L 盐酸调 pH 至 6.0 左右， 这样才能充分溶解。 4．加入一定量 NaHCO3调节 pH 至 7.0 左右。 5．加水至最终体积。 6．在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入 250mL 或 500mL 玻璃瓶中，用翻帽 塞塞紧瓶口。 7．瓶口封好，4℃冰箱贮存（RPMIl640 培养基可以-20℃贮存）。 （三）小牛血清的处理 市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理， 即通过加热的方法破坏补体（近来也有观点认为热灭活处理是不必要的）。 1．将血清加热至 56℃并保持 30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止 沉淀析出。 2．处理后的血清贮存于 4℃。 3．小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量（见八、新生牛血清的筛 选）。 （四）生长培养基的配制 除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清和抗菌 素。 1．培养基分装成小瓶（100～200mL）以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 2．按如下比例配制： 基本培养基占 80%～90%，小牛血清占 10%～20%。 按 1%体积分数加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度 分别为 100U/mL 和 100μg/mL。 （五）注意事项 1．培养细胞使用的瓶子和饭盒应与提取 RNA 和培养细菌的瓶子和饭盒严格分开。 因为用于处理提取 RNA 的 DEPC 水（0.1%焦炭酸二乙酯）是一种致癌剂，并可能 影响细胞生长；而培养过细菌的用品也不应与细胞混用。 2．过滤时压力不要太大，以压力数字 2 为宜，否则细菌易滤过达不到除菌效果， 或使滤膜破裂。分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中（分装量为 使用 3～5 次用完为宜，并且每瓶只能装 2/3 体积的液体，过多时瓶子易爆或胶 塞自喷）。 3．滤器用毕立即刷洗，过蒸馏水，晾干收藏。 四、抗原与免疫血清的制备 （一） 血细胞抗原的制备 采取兔子静脉血 0.2ml，用肝素抗凝。低速离心，收集血细胞，用 0.9% NaCl 调整细胞浓度至 4×107个/ml。 （二） 大肠杆菌抗原的制备 吸取灭菌的 0.5%石碳酸生理盐水 5ml，注入大肠杆菌斜面培养物上，将菌苔
洗下。用无菌毛细滴管吸取洗下的菌液，注入无菌小试管。将此含有菌液的小试管放60℃的水浴箱中1h，并不时摇动。取一与比浊管同质量的小试管，加菌液1ml，再加石碳酸生理盐水4ml（或更多，视原菌液浓度而定），混匀后与各比浊管比浊，假若与第3管的浊度相等，则此菌液每毫升的细菌数为5×900000000=4500000000（45亿）附McFarland比浊管配制法（取同质量同大小的试管10支，按下表加入药品）：表4-3细菌抗原的测定数目563M78910试管号120.10. 20.30. 40. 50.60.70.80. 91. 01% BaC12/ml1%H2SO/ml9. 99.89.79.69.59. 49. 39.29. 19.036912151821242730PFU（亿）/ml用0.5%石碳酸生理盐水将菌液稀释至每毫升含9亿个细菌。将已稀释号的菌悬液接种少量于肉汤培养基中，培养24-28h，观察有无细菌生长，如无细菌生长，即可放冰箱备用。（三）免疫小鼠先将此试验所需的试剂准备好。向2只小鼠的腹腔分别注射0.5ml的灭活的大肠杆菌，向另2只小鼠的腹腔内分别注射0.2ml的血清。每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次。（四）血清效价测定ELISA法：在酶标滴定板内加0.05m1抗原，置湿盒内4℃过夜，去抗原溶液，用洗涤液重复洗3次，每次3min。然后去洗涤液，加入0.05ml待测样品，置湿盒内，37℃，放置1小时，同时设阴、阳性对照。1小时后用洗涤液重复洗3次，每次3min。然后加入0.05mlHRP-羊抗鼠IgG，置湿盒内，37℃，放置1小时。1小时后用洗涤液重复洗3次，每次3min。然后加入0.05ml新配底物溶液，置湿盒内，37℃，放置30min，然后加入0.05ml终止反应液。观察各孔的颜色，用酶标测定仪测定OD490光吸收值。（五）凝集反应玻片凝集法：在玻片的一端加一滴1：10大肠杆菌免疫血清，另一端加一滴生理盐水。用接种环自大肠杆菌琼脂斜面上挑取少许细菌混入生理盐水内，并搅22
22 洗下。用无菌毛细滴管吸取洗下的菌液，注入无菌小试管。将此含有菌液的小试 管放 60℃的水浴箱中 1h，并不时摇动。取一与比浊管同质量的小试管，加菌液 1ml，再加石碳酸生理盐水 4ml(或更多，视原菌液浓度而定)，混匀后与各比浊 管比浊，假若与第 3 管的浊度相等，则此菌液每毫升的细菌数为： 5×900000000=4500000000(45 亿) 附 McFarland 比浊管配制法（取同质量同大小的试管 10 支，按下表加入药品）： 表 4-3 細菌抗原的测定数目 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1% BaCl2/ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1% H2SO4/ml 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 PFU（亿）/ml 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 用 0.5%石碳酸生理盐水将菌液稀释至每毫升含 9 亿个细菌。将已稀释号的 菌悬液接种少量于肉汤培养基中，培养 24-28h，观察有无细菌生长，如无细菌 生长，即可放冰箱备用。 （三）免疫小鼠 先将此试验所需的试剂准备好。向 2 只小鼠的腹腔分别注射 0.5ml 的灭活的 大肠杆菌，向另 2 只小鼠的腹腔内分别注射 0.2ml 的血清。每隔 15 天重复注射 作加强免疫，共重复 2 次。 （四）血清效价测定 ELISA 法：在酶标滴定板内加 0.05ml 抗原，置湿盒内 4℃过夜，去抗原溶液， 用洗涤液重复洗 3 次，每次 3min。然后去洗涤液，加入 0.05ml 待测样品，置湿 盒内，37℃，放置 1 小时，同时设阴、阳性对照。1 小时后用洗涤液重复洗 3 次， 每次 3min。然后加入 0.05mlHRP-羊抗鼠 IgG，置湿盒内，37℃，放置 1 小时。1 小时后用洗涤液重复洗 3 次，每次 3min。然后加入 0.05ml 新配底物溶液，置湿 盒内，37℃，放置 30min，然后加入 0.05ml 终止反应液。观察各孔的颜色，用 酶标测定仪测定 OD490光吸收值。 （五）凝集反应 玻片凝集法：在玻片的一端加一滴 1:10 大肠杆菌免疫血清，另一端加一滴 生理盐水。用接种环自大肠杆菌琼脂斜面上挑取少许细菌混入生理盐水内，并搅