第五篇实验技术及抗寄生虫药物 第十七章寄生虫病原检查技术 寄生虫学诊断技术包括病原检查、免疫学检查和分子生物学检查 等三个方面。本节将主要对病原检查的各种技术方法作一较全面的介 绍 第一节粪便检査 粪便检査是诊断寄生虫病常用的病原学检测方法。要取得准确 的结果,粪便必须新鲜,送检时间一般不宜超过24小时。如检查肠 内原虫滋养体,最好立即检查,或暂时保存在35°C~37°C条件下 待査。盛粪便的容器须洁净、干燥,并防止污染;粪便不可混入尿液 及其它体液等,以免影响检査结果。具体方法如下 (一)直接涂片法( direct smear method) 用以检査蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法简便,连续作3次 涂片,可以提高检出率 1.蠕虫卵检査滴一滴生理盐水于洁浄的载玻片上,用棉签棍 或牙签挑取绿豆大小的粪便块,在生理盐水中涂抹均匀;涂片的厚度
1 第五篇 实验技术及抗寄生虫药物 第十七章 寄生虫病原检查技术 寄生虫学诊断技术包括病原检查、免疫学检查和分子生物学检查 等三个方面。本节将主要对病原检查的各种技术方法作一较全面的介 绍 第一节 粪便检查 粪便检查是诊断寄生虫病常用的病原学检测方法。要取得准确 的结果，粪便必须新鲜，送检时间一般不宜超过 24 小时。如检查肠 内原虫滋养体，最好立即检查，或暂时保存在 35°C～37°C 条件下 待查。盛粪便的容器须洁净、干燥，并防止污染；粪便不可混入尿液 及其它体液等，以免影响检查结果。具体方法如下： （一）直接涂片法（direct smear method） 用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法简便，连续作 3 次 涂片，可以提高检出率。 1．蠕虫卵检查 滴一滴生理盐水于洁净的载玻片上，用棉签棍 或牙签挑取绿豆大小的粪便块，在生理盐水中涂抹均匀；涂片的厚度
以透过玻片隐约可辨认书上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查,如用 高倍镜观察,需加盖片。应注意虫卵与粪便中的异物鉴别。虫卵都具 有一定形状和大小;卵壳表面光滑整齐,具固有的色泽;卵内含卵细 胞或幼虫。 2.原虫检查 (1)活滋养体检査:涂片应较薄,方法同査蠕虫卵。气温愈接 近体温,滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。 (2)包囊的碘液染色检査:直接涂片方法同上,以一滴碘液代 替生理盐水,粪便涂抹方法同上。若同时需检査活滋养体,可在玻片 另一侧滴一滴生理盐水。同上法涂抹粪便标本,再盖上盖片。片中滴 碘液的一侧查包囊;另一侧查活滋养体。 碘液配方:碘化钾4g,碘2g,蒸馏水100mnl (3)隐孢子虫卵囊染色检查:目前最佳的方法为金安-酚改良抗 酸染色法。其次为金胺酚染色法和改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或 经10%福尔马林固定保存(4℃1个月内)的含卵囊粪便都可用这三 种方法染色。染色过程是先用金胺-酚染色,再用改良抗酸染色法复 染。方法步骤如下 金胺一酚( auramine-phenol)染色法: 1)染液配制:1g/1金胺一酚染色液(第一液):金胺0.1g,石 炭酸5.0g,蒸馏水l00ml;3%盐酸酒精(第二液):盐酸3ml,95%酒
2 以透过玻片隐约可辨认书上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查，如用 高倍镜观察，需加盖片。应注意虫卵与粪便中的异物鉴别。虫卵都具 有一定形状和大小；卵壳表面光滑整齐，具固有的色泽；卵内含卵细 胞或幼虫。 2．原虫检查 (1) 活滋养体检查：涂片应较薄，方法同查蠕虫卵。气温愈接 近体温，滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。 （2）包囊的碘液染色检查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代 替生理盐水，粪便涂抹方法同上。若同时需检查活滋养体，可在玻片 另一侧滴一滴生理盐水。同上法涂抹粪便标本，再盖上盖片。片中滴 碘液的一侧查包囊；另一侧查活滋养体。 碘液配方：碘化钾 4g，碘 2g，蒸馏水 100ml。 （3）隐孢子虫卵囊染色检查：目前最佳的方法为金安-酚改良抗 酸染色法。其次为金胺酚染色法和改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或 经 10%福尔马林固定保存（4℃1 个月内）的含卵囊粪便都可用这三 种方法染色。染色过程是先用金胺-酚染色，再用改良抗酸染色法复 染。方法步骤如下： 金胺－酚（auramine-phenol）染色法： 1)染液配制：1g/l 金胺—酚染色液（第一液）：金胺 0.1g，石 炭酸 5.0g，蒸馏水 100ml；3%盐酸酒精（第二液）：盐酸 3ml，95%酒
精100ml:;5g/l高锰酸钾液(第三液):高锰酸钾0.5g,蒸馏水100mn 2)染色步骤:滴加第一液于晾干的粪膜上,10~15分钟后水洗: 滴加第二液,1分钟后水洗;滴加第三液,1分钟后水洗,待干;置 荧光显微镜检査 低倍荧光镜下,可见卵囊为一圆形小亮点,发出乳白色荧光。高 倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色,卵囊壁为一薄层,多数卵囊周围深染, 中央淡染,呈环状,核深染结构偏位,有些卵囊全部为深染。但有些 标本可出现非特异的荧光颗粒,应注意鉴别。 改良抗酸( modified acid- fast met hod)染色法: 1)染色液配制:石炭酸复红染色液(第一液):碱性复红4g,95% 酒精2Ⅷml,石炭酸8ml,蒸馏水lo0ml;10%硫酸溶液(第二液):纯 硫酸10ml,蒸馏水9ωml(边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中);20g/1孔 雀绿液(第三液):20g/1孔雀绿原液1ml,蒸馏水10ml 2)染色步骤:滴加第一液于晾干的粪膜上,1.5~10分钟后水洗: 滴加第二液,1~10分钟后水洗;滴加第三液,1分钟后水洗,待干; 置显微镜下观察, 经染色后,卵囊呈玫瑰红色,圆形或椭圆形,背景为绿色。如染 色(1.5分钟)和脱色(2分钟)时间短,卵囊内子孢子边界不明显; 如染色时间长(5~10分钟)脱色时间需相应延长,子孢子边界明显。 卵囊内子孢子均染为玫瑰红色,子孢子呈月牙形,共4个。其他非特
3 精 100ml；5g/l 高锰酸钾液（第三液）：高锰酸钾 0.5g，蒸馏水 100ml。 2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，10～15 分钟后水洗； 滴加第二液，1 分钟后水洗；滴加第三液，1 分钟后水洗，待干；置 荧光显微镜检查。 低倍荧光镜下，可见卵囊为一圆形小亮点，发出乳白色荧光。高 倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色，卵囊壁为一薄层，多数卵囊周围深染， 中央淡染，呈环状，核深染结构偏位，有些卵囊全部为深染。但有些 标本可出现非特异的荧光颗粒，应注意鉴别。 改良抗酸（modified acid-fast method）染色法： 1)染色液配制：石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红 4g，95% 酒精 20ml，石炭酸 8ml，蒸馏水 100ml；10%硫酸溶液（第二液）：纯 硫酸 10ml，蒸馏水 90ml（边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中）；20g/l 孔 雀绿液（第三液）：20g/l 孔雀绿原液 1ml，蒸馏水 10ml。 2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，1.5～10 分钟后水洗； 滴加第二液，1～10 分钟后水洗；滴加第三液，1 分钟后水洗，待干； 置显微镜下观察。 经染色后，卵囊呈玫瑰红色，圆形或椭圆形，背景为绿色。如染 色（1.5 分钟）和脱色（2 分钟）时间短，卵囊内子孢子边界不明显； 如染色时间长（5～10 分钟）脱色时间需相应延长，子孢子边界明显。 卵囊内子孢子均染为玫瑰红色，子孢子呈月牙形，共 4 个。其他非特
异颗粒则染成蓝黑色,容易与卵囊区分 不具备荧光镜的实验室,亦可用本方法先染色,然后在光镜低、 高倍下过筛检査。如发现小红点再用油镜观察的效果好,可提高检出 速度和准确性。 金胺一酚染色一改良抗酸复染法 用本法可克服上述染色法的缺点。具体方法是:先用金胺酚染色 后,再用改良抗酸染色法复染。再用光学显微镜观察,卵囊同抗酸染 色法所见,但非特异性颗粒被染成兰黑色,两者颜色截然不同,极易 鉴别,使检出率和准确性大大提高 (二)厚涂片透明法(改良加藤法)( modified Kato' s thick smear) 厚涂片透明法适于蠕虫卵检査。取约50mng(已用100目不锈钢筛 除去粪渣)粪便,置于载玻片上,覆以浸透甘油—孔雀绿溶液的玻璃 纸片,轻压,使粪便铺开(20×25m)。置于30~36℃温箱中约半小 时或25℃约1小时。待粪膜稍干,即可镜检 玻璃纸准备:将玻璃纸剪成22×30m大小的小片,浸于甘油一孔 雀绿溶液(含纯甘油100m1、水100m1和1m13%孔雀绿水溶液)中至 少浸泡24小时,至玻璃纸呈现绿色。 使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间,如粪膜厚透明时 间短,虫卵难以发现;如透明时间过长则虫卵变形,也不易辨认。如
4 异颗粒则染成蓝黑色，容易与卵囊区分。 不具备荧光镜的实验室，亦可用本方法先染色，然后在光镜低、 高倍下过筛检查。如发现小红点再用油镜观察的效果好，可提高检出 速度和准确性。 金胺－酚染色－改良抗酸复染法 用本法可克服上述染色法的缺点。具体方法是：先用金胺酚染色 后，再用改良抗酸染色法复染。再用光学显微镜观察，卵囊同抗酸染 色法所见，但非特异性颗粒被染成兰黑色，两者颜色截然不同，极易 鉴别，使检出率和准确性大大提高。 （二）厚涂片透明法（改良加藤法）（modified Kato’s thick smear） 厚涂片透明法适于蠕虫卵检查。取约 50mg（已用 100 目不锈钢筛 除去粪渣）粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油—孔雀绿溶液的玻璃 纸片，轻压，使粪便铺开（20×25mm）。置于 30～36℃温箱中约半小 时或 25℃约 1 小时。待粪膜稍干，即可镜检。 玻璃纸准备：将玻璃纸剪成 22×30mm 大小的小片，浸于甘油—孔 雀绿溶液（含纯甘油 100ml、水 100ml 和 1ml 3%孔雀绿水溶液）中至 少浸泡 24 小时，至玻璃纸呈现绿色。 使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间，如粪膜厚透明时 间短，虫卵难以发现；如透明时间过长则虫卵变形，也不易辨认。如
检查钩虫卵时,透明时间宜在30分钟以内。 (三)浓聚法( concentration method) 1.沉淀法( sedimentation method)原虫包囊和蠕虫卵的比重 大可沉积于水底,有助于提高检出率。但比重较小的钩虫卵和某些原 虫包囊则效果较差 (1)重力沉淀法:即自然沉淀法。本法主要用于蠕虫卵检査,蠕 虫卵比重大于水,可沉于水底,使虫卵浓集。加之,经水洗后,视野 清晰,易于检查。有些虫卵,如钩虫卵,比重较轻,应用此法效果不 佳。本法缺点为费时,操作烦琐 取粪便20~30g、加水制成混悬液,用金属筛(40~60孔)或2、 3层湿纱布过滤,再加清水冲洗残渣;过滤粪液在容器中静置25分 钟,到去上液,重新加满清水,以后每隔15~20分钟换水一次(共 3~4次),直至上清液清晰为止。最后倒去上清液,取沉渣作涂片镜 检。检査血吸虫卵时,沉淀时间不宜过长,尤在室温高于15°C时, 卵内毛蚴易孵化。当检查包囊时,换水间隔时间宜延长至约6小时(图 17-1) 图17-1粪便自然沉淀法及毛蚴孵化法 (2)离心沉淀法( centrifugal sedimentation method):将上 述滤去粗渣的粪液离心(1500-2000rpm/min)1~2分钟,倒去上液
5 检查钩虫卵时，透明时间宜在 30 分钟以内。 (三)浓聚法（concentration method） 1.沉淀法（sedimentation method）原虫包囊和蠕虫卵的比重 大可沉积于水底，有助于提高检出率。但比重较小的钩虫卵和某些原 虫包囊则效果较差。 (1)重力沉淀法：即自然沉淀法。本法主要用于蠕虫卵检查，蠕 虫卵比重大于水，可沉于水底，使虫卵浓集。加之，经水洗后，视野 清晰，易于检查。有些虫卵，如钩虫卵，比重较轻，应用此法效果不 佳。本法缺点为费时，操作烦琐。 取粪便 20～30g、加水制成混悬液，用金属筛（40～60 孔）或 2、 3 层湿纱布过滤，再加清水冲洗残渣；过滤粪液在容器中静置 25 分 钟，到去上液，重新加满清水，以后每隔 15～20 分钟换水一次（共 3～4 次），直至上清液清晰为止。最后倒去上清液，取沉渣作涂片镜 检。检查血吸虫卵时，沉淀时间不宜过长，尤在室温高于 15 C 时， 卵内毛蚴易孵化。当检查包囊时，换水间隔时间宜延长至约 6 小时（图 17-1）。 图 17-1 粪便自然沉淀法及毛蚴孵化法 （2）离心沉淀法（centrifugal sedimentation method）：将上 述滤去粗渣的粪液离心（1500-2000rpm/min）1～2 分钟，倒去上液