中山大学：《人体寄生虫学》第十八章 寄生虫的人工培养及动物模型

第十八章寄生虫的人工培养及动物模型 第一节寄生虫的人工培养 溶组织内阿米巴培养 可分有菌培养( xenic culture)和无菌培养( axenic culture) (一)有菌培养 主要用 Robinson’s培养基,不仅可以培养溶组织内阿米巴,也 可以培养哈门氏内阿米巴、结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴等多种阿 米巴。一般应用6ml7ml或更小的螺旋有盖培养管。 组成成分 (1)盐水琼脂斜面:溶解15g琼脂粉和7g8g氯化钠于1000nl 蒸馏水中,分装在小试管中高压灭菌(121℃,15min),当琼脂冷却至 75℃左右倾放使其形成斜面 (2)红霉素:将0.5g实验室用红霉素粉剂置于无菌容器中,加 入20m170%乙醇溶解,4℃放置2h以上,而后加灭菌水至50ml (3)米粉:梗米粉经高压消毒或180℃千燥灭菌。 (4)配制50mmo1邻苯二甲酸氢钾,pH6.3,高压灭菌。 (5)血清:56℃30min灭活,甚至未灭活的牛或马血清均可使 用 (6)R溶液贮存液:№aCl50g(^H)aSO410g柠檬酸.2H020g

1 第十八章 寄生虫的人工培养及动物模型 第一节 寄生虫的人工培养 一、溶组织内阿米巴培养 可分有菌培养(xenic culture)和无菌培养(axenic culture) （一）有菌培养 主要用 Robinson’s 培养基，不仅可以培养溶组织内阿米巴，也 可以培养哈门氏内阿米巴、结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴等多种阿 米巴。一般应用 6ml~7ml 或更小的螺旋有盖培养管。 1．组成成分： （1）盐水琼脂斜面：溶解 15g 琼脂粉和 7g~8g 氯化钠于 1000ml 蒸馏水中，分装在小试管中高压灭菌(121℃,15min)，当琼脂冷却至 75℃左右倾放使其形成斜面。 （2）红霉素：将 0.5g 实验室用红霉素粉剂置于无菌容器中，加 入 20ml 70%乙醇溶解，4℃放置 2h 以上，而后加灭菌水至 50ml。 （3）米粉：梗米粉经高压消毒或 180℃干燥灭菌。 （4）配制 50mmol 邻苯二甲酸氢钾，pH6.3，高压灭菌。 （5）血清：56℃ 30min 灭活，甚至未灭活的牛或马血清均可使 用。 （6）R 溶液贮存液：NaCl 50g (NH4) 2SO4 10g 柠檬酸.2H2O 20g

MgS0…7H200.5g KH 2PO4 5g 乳酸(90%纯度)4m1,加水至950ml,调节pH至7.0,最终调节容 量至1000ml,分装高压灭菌,制备成贮存工作液。使用时将100ml 贮存液加入850ml双蒸水,调节pH7.0分装高压灭菌。 (7⑦)BR溶液:25m1R工作液与1个克隆的大肠杆菌,37℃振摇 培养48小时 (8)BRS溶液:在上述R溶液中加入等量血清,继续培养24~48 小时即可。 2.操作步骤 在含琼脂斜面的培养试管中加入10mg米粉、120μl红霉素液和 足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和BRS液4:1混合液,加入少量(约 50mg粪便,混匀,37℃培养24小时后,移去培养上清液,加适量入 4:1混合液并加入60μl红霉素和米粉。37℃继续培养48小时后,取 米粉与粪渣混合物一滴,以碘液染色或直接观察有无滋养体;若未发 现虫体再加入米粉,再培养24小时观察。若虫体阳性可将少量培养 混合液转入新鲜培养基中继续培养,即为转种, (二)无菌培养 最常用是BIS-33培养基,为液体培养基。培养在6m的玻璃有 盖培养管中,由于阿米巴为兼性厌氧代谢,故应紧盖管盖,并呈5° 的角度放置。虫体对培养基和血清的要求甚高,甚至水质也会影响其 生长,并非一般实验室可行。目前我国生产的培养基试剂尚不能成功 培养虫体。BIS-33培养基含三个组分,即营养液、维生素混合液

2 MgSO4.7H2O 0.5g KH 2PO4 5g 乳酸(90%纯度) 4ml，加水至 950ml，调节 pH 至 7.0，最终调节容 量至 1000ml，分装高压灭菌，制备成贮存工作液。使用时将 100ml 贮存液加入 850ml 双蒸水，调节 pH7.0 分装高压灭菌。 （7）BR 溶液：25ml R 工作液与 1 个克隆的大肠杆菌，37℃振摇 培养 48 小时。 （8）BRS 溶液：在上述 BR 溶液中加入等量血清，继续培养 24~48 小时即可。 2．操作步骤 在含琼脂斜面的培养试管中加入 10mg 米粉、120l 红霉素液和 足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和BRS 液4:1 混合液，加入少量(约 50mg)粪便，混匀，37℃培养 24 小时后，移去培养上清液，加适量入 4:1 混合液并加入 60l 红霉素和米粉。37℃继续培养 48 小时后，取 米粉与粪渣混合物一滴，以碘液染色或直接观察有无滋养体；若未发 现虫体再加入米粉，再培养 24 小时观察。若虫体阳性可将少量培养 混合液转入新鲜培养基中继续培养，即为转种。 （二）无菌培养 最常用是 BIS-33 培养基，为液体培养基。培养在 6ml 的玻璃有 盖培养管中，由于阿米巴为兼性厌氧代谢，故应紧盖管盖，并呈 5 的角度放置。虫体对培养基和血清的要求甚高，甚至水质也会影响其 生长，并非一般实验室可行。目前我国生产的培养基试剂尚不能成功 培养虫体。BIS-33 培养基含三个组分，即营养液、维生素混合液

成牛血清。 (1)营养液:KlPO41.0gKH2PO40.6gNaC12g L~半胱氨酸Hl1g维生素C0.2g 枸橼酸铁胺22.8mg葡萄糖10g 消化蛋白胨,酵母提取物30g 溶于60Oml双蒸水中,调节p至6.8,最终容量调至870ml,分 装,高压消毒后,冷却至20°贮存。 (2)维生素培养液 有多种,如下一种是最易配制的。 溶液A:烟酰胺45mg;盐酸维生素Bs4ng;泛酸钙23mg;盐酸 硫胺5mg;维生素B121.2mg,均溶于双蒸水,定容至 25ml; 溶液B:核黄素mg(加0. IN NaOH数微升使其易溶解)加双蒸水 至 45m1 溶液C:叶酸5.5mg(加0. IN NaOr数微升使其易溶解)加双蒸水 至45m1; 溶液D:d-生物素2ng,加双蒸水至45m; 溶液E:DL-6,8-硫辛酸lmg,溶于5m95%乙醇中,加入500mg Tween80并定容至200m1,0.2um滤膜过滤灭菌,4℃ 暗处保存。 (3)成牛血清

3 成牛血清。 （1）营养液：K2HPO4 1.0g KH 2PO4 0.6g NaCl 2g L~半胱氨酸~HCl 1g 维生素 C 0.2g 枸橼酸铁胺 22.8mg 葡萄糖 10g 消化蛋白胨，酵母提取物 30g 溶于 600ml 双蒸水中，调节 pH 至 6.8，最终容量调至 870ml，分 装，高压消毒后，冷却至-20贮存。 （2）维生素培养液 有多种，如下一种是最易配制的。 溶液 A：烟酰胺 45mg; 盐酸维生素 B6 4mg; 泛酸钙 23mg; 盐酸 硫胺 5mg; 维生素 B12 1.2mg，均溶于双蒸水，定容至 25ml; 溶液 B：核黄素 7mg(加 0.1N NaOH 数微升使其易溶解)加双蒸水 至 45ml; 溶液 C：叶酸 5.5mg(加 0.1N NaOH 数微升使其易溶解) 加双蒸水 至 45ml; 溶液 D：d-生物素 2mg，加双蒸水至 45ml; 溶液 E：DL-6,8-硫辛酸 1mg，溶于 5ml 95%乙醇中，加入 500mg Tween 80 并定容至 200ml，0.2m 滤膜过滤灭菌，4℃ 暗处保存。 （3）成牛血清

成牛血清需经4小时左右灭活方可用于培养,但需避免反复冻 (4)完全培养剂 营养液87ml,成牛血清10ml或15ml,维生素混合液2ml,混合, 冷藏,随时可用。应用6ml的螺旋有盖培养管,36±0.5℃培养,7296 小时转种一次。可将向有菌培养的滋养体与37℃的BIS-33培养基混 匀,使米粉等粗颗粒自然沉淀,取含滋养体的上清液通过滤纸,400g 2min离心,弃上清液。将含滋养体的沉淀溶入含青霉素、链霉素、 卡那霉素、多粘菌素的BIS-33培养液中,并加入数滴福尔马林固定 的短膜虫,在6nl螺旋有盖培养管中培养。24小时后可见滋养体贴 附试管壁,换一次培养液,继续培养48小时或72小时后转种,使其 逐渐转为无菌培养,并可进一步克隆化。 阴道毛滴虫培养 可分有菌培养和无菌培养。 1.有菌培养 主要是肝胨糖培养基。一般应用12ml或6ml的螺旋有盖培养管, 可从病人阴道后穹隆取材直接放入培养管中,加入青霉素1000/mnl, 链霉素1mg/ml,以除去杂菌,36±0.5℃培养。 具体配制方法为,取小牛肝脏60g,清洗粉碎,浸入400m蒸馏 水中,4℃过夜。而后煮沸1小时左右,纱布过滤,最终调节容量至

4 成牛血清需经 4 小时左右灭活方可用于培养，但需避免反复冻 融。 （4）完全培养剂 营养液 87ml，成牛血清 10ml 或 15ml，维生素混合液 2ml，混合， 冷藏，随时可用。应用 6ml 的螺旋有盖培养管，360.5℃培养，72~96 小时转种一次。可将向有菌培养的滋养体与 37℃的 BIS-33 培养基混 匀，使米粉等粗颗粒自然沉淀，取含滋养体的上清液通过滤纸，400g 2min 离心，弃上清液。将含滋养体的沉淀溶入含青霉素、链霉素、 卡那霉素、多粘菌素的 BIS-33 培养液中，并加入数滴福尔马林固定 的短膜虫，在 6ml 螺旋有盖培养管中培养。24 小时后可见滋养体贴 附试管壁，换一次培养液，继续培养 48 小时或 72 小时后转种，使其 逐渐转为无菌培养，并可进一步克隆化。 二、阴道毛滴虫培养 可分有菌培养和无菌培养。 1．有菌培养 主要是肝胨糖培养基。一般应用 12ml 或 6ml 的螺旋有盖培养管， 可从病人阴道后穹隆取材直接放入培养管中，加入青霉素 1000u/ml， 链霉素 1mg/ml，以除去杂菌，360.5℃培养。 具体配制方法为，取小牛肝脏 60g，清洗粉碎，浸入 400ml 蒸馏 水中，4℃过夜。而后煮沸 1 小时左右，纱布过滤，最终调节容量至

400m1,分装,4℃贮存。取100ml上述肝浸汤加入蛋白胨2g和葡萄 糖0.5g,调节p至5.5~6.0,5m或2.5ml分装,20分钟高压灭菌, 使用前加入15%灭活牛血清。 2.无菌培养 应用前述的BIS-33培养基,将p调节至5.8,应用10%成牛血清, 培养管如同阿米巴培养所用。从有菌转入无菌时,应加入适量适当的 抗菌素以杀死细菌,例如青霉素、链霉素、卡那霉素等。 三、蓝氏贾第鞭毛虫培养 蓝氏贾第鞭毛虫可以直接从病人粪便或十二指肠液或胆汁中直 接进行无菌培养,而无需从有菌培养或混合培养( monoxenic culture) 转化。所用试管如溶组织内阿米巴无菌培养所述,培养温度36±0.5 ℃。培养基即为BIS-33,但可作如下改良即:①L-半胱氨酸HCl加 倍;②每1升培养液加入500mg脱氢牛胆汁 (dehy drogenate bovine bile);③p为7.0~7.2;④培养液以0.2μm的滤膜过滤除菌,在 过滤前高速离心可以除去较大的杂质以便过滤。⑤应用10%的成牛 血清。⑥无需维生素混合液 四、隐孢子虫培养 在隐孢子虫生活史中只有囊合子和子孢子可以从实验动物或感

5 400ml，分装，4℃贮存。取 100ml 上述肝浸汤加入蛋白胨 2g 和葡萄 糖 0.5g，调节 pH 至 5.5~6.0，5ml 或 2.5ml 分装，20 分钟高压灭菌， 使用前加入 15%灭活牛血清。 2．无菌培养 应用前述的 BIS-33 培养基，将 pH 调节至 5.8，应用 10%成牛血清， 培养管如同阿米巴培养所用。从有菌转入无菌时，应加入适量适当的 抗菌素以杀死细菌，例如青霉素、链霉素、卡那霉素等。 三、蓝氏贾第鞭毛虫培养 蓝氏贾第鞭毛虫可以直接从病人粪便或十二指肠液或胆汁中直 接进行无菌培养，而无需从有菌培养或混合培养(monoxenic culture) 转化。所用试管如溶组织内阿米巴无菌培养所述，培养温度 360.5 ℃。培养基即为 BIS-33，但可作如下改良即：① L-半胱氨酸-HCl 加 倍；② 每 1 升培养液加入 500mg 脱氢牛胆汁(dehydrogenate bovine bile)；③ pH 为 7.0~7.2；④ 培养液以 0.2m 的滤膜过滤除菌，在 过滤前高速离心可以除去较大的杂质以便过滤。⑤ 应用 10%的成牛 血清。⑥ 无需维生素混合液。 四、隐孢子虫培养 在隐孢子虫生活史中只有囊合子和子孢子可以从实验动物或感