现出的有益变异，筛选出抗马铃薯早疫病的无性系，并己在大田试验。体细胞杂交可以克服 有性杂交不亲和性，或用于转移母性遗传性状，如分别由叶绿体和线粒体基因控制的不同的 除草剂阿特拉津抗性和雄性不育性状等。利用非对称融合技术，将采用X-射线处理抑制核活 性的雄性不有系（供体），与用碘乙酰胺处理抑制胞质活性的受体进行原生质体融合，获得具 有雄性不育性状的二倍体胞质杂种，而且雄性不育性状可稳定地遗传。 四、染色体工程 按照特定目标，通过对染色体操纵，来改变染色体的组成，并进而改变其遗传特性的过 程叫染色体工程。通常包括倍性育种（单倍体与多倍体育种）、体细胞杂交、染色体的遗传操 作（异附加系、异代换系等）以及染色体微切割、人工染色体等。此处仅就染色体微切割、 人工染色体作一介绍。 1.染色体微切割、微克隆 染色体微切割(microdissection)、微克隆(microcloning)是指在显微镜下利用特种工具， 对特定染色体片段进行微切割加工，并从分离相中分离出来，进行DNA体外扩增并克隆到 载体中以构建特定染色体区段、特异性DNA文库的技术。该技术首先在动物及人类遗传中 建立，1991年首次应用到植物中。目前已有多种植物，如番茄、柚、银杏、大豆、百合、蚕 豆等的染色体显微分离、文库构建与特定序列的克隆。 目标染色体分离克隆的前提是高质量的染色体制片。染色体大小、臂比、随体有无等形 态特征是识别染色体的最常用的依据。端着丝粒染色体形态独特，无需分带和荧光染色即可 在有丝分裂中期加以辨认，因而是理想的微切割材料，可提高分辨率、准确性，也可通过分 带或荧光原位杂交等技术加以鉴别。 常用的切割工具有两种：一种是在显微操作仪上用（一种特制的玻璃毛细管针），有时结 合激光微束（氩离子、N2)将某个染色体片段切下来，另一种方法采用激光共聚焦显微镜将 非目标染色体片段消除。 微克隆方法有两种：一是酶解直接克隆法，目标染色体片段经蛋白酶裂解后提取出目标 片段DNA,由于目标染色体DNA的量很少，最初的染色体微切割需切割分离大量染色体 (100-200条)：另一是PCR介导克隆法，PCR技术的应用大大促进了染色体微切割、微克 隆技术的发展。单条染色体经内切酶消化后，在DNA片段两端加接头，接头内可包含根据 克隆需要而设计的内切酶位点，并根据接头序列设计引物进行PC扩增。扩增产物可进行微 克隆、构建成染色体或染色体片段DNA文库。 目前染色体微切割仍局限于构建特定染色体和特定染色体片段的DNA文库。这种文库 可用来筛选目标基因的候选克隆，也可以从中筛选对某个染色体区段有特异性的探针，这些 探针属于同一连锁群，因而可用来构建高密度分子标记连锁图，进行YAC、BAC文库筛选。 2.人工染色体 真核生物染色体呈线状，着丝粒、端粒和复制起始点是真核生物染色体的最基本的组成 元件。在细胞分裂中期，纺锤丝维管结合到染色体的着丝粒区域的着丝点上，牵动染色体有 规则地分配到子细胞中；端粒即真核生物染色体的2个真正的末端，起着将染色体顶端“封 口”、保护染色体结构稳定和维持其长度完整的作用，没有端粒的染色体末端为粘性末端，可
11 现出的有益变异，筛选出抗马铃薯早疫病的无性系，并己在大田试验。体细胞杂交可以克服 有性杂交不亲和性，或用于转移母性遗传性状，如分别由叶绿体和线粒体基因控制的不同的 除草剂阿特拉津抗性和雄性不育性状等。利用非对称融合技术，将采用 X-射线处理抑制核活 性的雄性不育系（供体），与用碘乙酰胺处理抑制胞质活性的受体进行原生质体融合，获得具 有雄性不育性状的二倍体胞质杂种，而且雄性不育性状可稳定地遗传。 四、染色体工程 按照特定目标，通过对染色体操纵，来改变染色体的组成，并进而改变其遗传特性的过 程叫染色体工程。通常包括倍性育种（单倍体与多倍体育种）、体细胞杂交、染色体的遗传操 作（异附加系、异代换系等）以及染色体微切割、人工染色体等。此处仅就染色体微切割、 人工染色体作一介绍。 1．染色体微切割、微克隆 染色体微切割（microdissection）、微克隆（microcloning）是指在显微镜下利用特种工具， 对特定染色体片段进行微切割加工，并从分离相中分离出来，进行 DNA 体外扩增并克隆到 载体中以构建特定染色体区段、特异性 DNA 文库的技术。该技术首先在动物及人类遗传中 建立，1991 年首次应用到植物中。目前已有多种植物，如番茄、柚、银杏、大豆、百合、蚕 豆等的染色体显微分离、文库构建与特定序列的克隆。 目标染色体分离克隆的前提是高质量的染色体制片。染色体大小、臂比、随体有无等形 态特征是识别染色体的最常用的依据。端着丝粒染色体形态独特，无需分带和荧光染色即可 在有丝分裂中期加以辨认，因而是理想的微切割材料，可提高分辨率、准确性，也可通过分 带或荧光原位杂交等技术加以鉴别。 常用的切割工具有两种：一种是在显微操作仪上用（一种特制的玻璃毛细管针），有时结 合激光微束（氩离子、N2）将某个染色体片段切下来，另一种方法采用激光共聚焦显微镜将 非目标染色体片段消除。 微克隆方法有两种；一是酶解直接克隆法，目标染色体片段经蛋白酶裂解后提取出目标 片段 DNA，由于目标染色体 DNA 的量很少，最初的染色体微切割需切割分离大量染色体 （100~200 条）；另一是 PCR 介导克隆法，PCR 技术的应用大大促进了染色体微切割、微克 隆技术的发展。单条染色体经内切酶消化后，在 DNA 片段两端加接头，接头内可包含根据 克隆需要而设计的内切酶位点，并根据接头序列设计引物进行 PCR 扩增。扩增产物可进行微 克隆、构建成染色体或染色体片段 DNA 文库。 目前染色体微切割仍局限于构建特定染色体和特定染色体片段的 DNA 文库。这种文库 可用来筛选目标基因的候选克隆，也可以从中筛选对某个染色体区段有特异性的探针，这些 探针属于同一连锁群，因而可用来构建高密度分子标记连锁图，进行 YAC、BAC 文库筛选。 2．人工染色体 真核生物染色体呈线状，着丝粒、端粒和复制起始点是真核生物染色体的最基本的组成 元件。在细胞分裂中期，纺锤丝维管结合到染色体的着丝粒区域的着丝点上，牵动染色体有 规则地分配到子细胞中；端粒即真核生物染色体的 2 个真正的末端，起着将染色体顶端“封 口”、保护染色体结构稳定和维持其长度完整的作用，没有端粒的染色体末端为粘性末端，可
与另一个染色体粘性末端相接：真核生物染色体的线性DNA分子由许多复制单位一一复制 子组成，每个复制子中央为复制起始点，这种复制起始点DNA称为自主复制序列因子 (Automatic replication sequence,ARS)。人们分离出端粒、着丝粒等染色体结构序列之后， 开始组装人工染色体。 目前人工染色体有酶母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)等。第一个酵母 人工染色体Murray和Szostak(1983)在大肠杆菌质粒pBR322基础上加入酵母着丝粒，ARS 及四膜虫的核糖体RNA基因末端(T,其结构和功能与端粒DNA相似)及基因，总长度为 10.7kb。目前，YAC已成为基因工程的主要载体和基因组分析的有力工具。现己构建了人、 牛、猪、绵羊、小鼠、果蝇等动物以及拟南芥、玉米、番茄、大麦、甜菜、水稻和马铃薯等 植物YAC文库。 细菌人工染色体是以大肠杆菌F因子为基础构建的，具有F因子遗传稳定的优点，可负 载小于35Okb的DNA片段。BAC的环状形式存在于E.coli中，在宿主菌中能稳定遗传，没 有缺失，重组和嵌合现象，转化效率高，极大方便了目的基因筛选。目前己构建了人、牛、 鼠、鸡、水稻、高粱等生物的BAC基因组文库。 第二节基因工程育种 植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、基因遗传转化技术及植物组织培养技术 的发展而兴起的生物技术。近年来，随着分子生物学研究取得一系列重要进展，园艺植物基 因工程已发展成为当今农业生物技术中最为活跃的领域之一。由于是在基因水平上改造植物 遗传物质，可定向改造遗传性状，提高了育种的目的性和精确性，打破物种间生殖隔离障碍， 实现了基因在生物界的共用性，因而在园艺植物重要园艺性状的遗传改良、抗逆抗病育种、 品质改良与种质创新等方面发挥着日益巨大的作用。 一、概况 近十几年来，全球转基因农作物产业化发展十分迅速。自1983年世界上第一例转基因植 物问世以来，转基因农作物研究和开发取得了一系列突破性进展。特别是1994年第一例转基 因作物番茄(Flavor saveR)在美国批准上市以来，转基因作物商品化生产和应用取得了突飞 猛进的发展。 目前，全球转基因植物已达35科120多种，主要作物为：玉米、棉花、番茄、大豆、油 菜、马铃薯等：试验的主要目标性状为：抗除草剂、抗虫、抗病毒病、品质改良、抗细菌与 真菌病害与抗逆性（盐、冷、旱、涝等）。其中己批准进行大面积环境释放和商品化生产应用 的转基因植物主要有大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、番茄、西葫芦、番木瓜等农作物。 我国研究的转基因植物种类50多种，涉及各类基因100多种（含标记基因）。目前正在研究 开发的转基因园艺植物种类主要有马铃薯、番茄、甜椒、白菜、花生、甜瓜、西瓜、番木瓜、 广霍香等。自1997年3月至2000年7月，我国共批准商品化生产35项，涉及4种作物（棉 花、番茄、甜椒、矮牵牛花)：批准环境释放81项（其中涉及番茄、甜椒、马铃薯、黄瓜、 杨树、玉米等作物)。预计全球范围内转基因植物产品市场销售额将由1996年不足5亿美元
12 与另一个染色体粘性末端相接；真核生物染色体的线性 DNA 分子由许多复制单位——复制 子组成，每个复制子中央为复制起始点，这种复制起始点 DNA 称为自主复制序列因子 （Automatic replication sequence, ARS）。人们分离出端粒、着丝粒等染色体结构序列之后， 开始组装人工染色体。 目前人工染色体有酶母人工染色体（YAC）和细菌人工染色体（BAC）等。第一个酵母 人工染色体 Murray 和 Szostak（1983）在大肠杆菌质粒 pBR322 基础上加入酵母着丝粒，ARS 及四膜虫的核糖体 RNA 基因末端（Tr，其结构和功能与端粒 DNA 相似）及基因，总长度为 10.7kb。目前，YAC 已成为基因工程的主要载体和基因组分析的有力工具。现已构建了人、 牛、猪、绵羊、小鼠、果蝇等动物以及拟南芥、玉米、番茄、大麦、甜菜、水稻和马铃薯等 植物 YAC 文库。 细菌人工染色体是以大肠杆菌 F 因子为基础构建的，具有 F 因子遗传稳定的优点，可负 载小于 350kb 的 DNA 片段。BAC 的环状形式存在于 E.coli 中，在宿主菌中能稳定遗传，没 有缺失，重组和嵌合现象，转化效率高，极大方便了目的基因筛选。目前已构建了人、牛、 鼠、鸡、水稻、高粱等生物的 BAC 基因组文库。 第二节 基因工程育种 植物基因工程是近 20 年来随着 DNA 重组技术、基因遗传转化技术及植物组织培养技术 的发展而兴起的生物技术。近年来，随着分子生物学研究取得一系列重要进展，园艺植物基 因工程已发展成为当今农业生物技术中最为活跃的领域之一。由于是在基因水平上改造植物 遗传物质，可定向改造遗传性状，提高了育种的目的性和精确性，打破物种间生殖隔离障碍， 实现了基因在生物界的共用性，因而在园艺植物重要园艺性状的遗传改良、抗逆抗病育种、 品质改良与种质创新等方面发挥着日益巨大的作用。 一、概况 近十几年来，全球转基因农作物产业化发展十分迅速。自 1983 年世界上第一例转基因植 物问世以来，转基因农作物研究和开发取得了一系列突破性进展。特别是 1994 年第一例转基 因作物番茄（Flavor saveR）在美国批准上市以来，转基因作物商品化生产和应用取得了突飞 猛进的发展。 目前，全球转基因植物已达 35 科 120 多种，主要作物为：玉米、棉花、番茄、大豆、油 菜、马铃薯等；试验的主要目标性状为：抗除草剂、抗虫、抗病毒病、品质改良、抗细菌与 真菌病害与抗逆性（盐、冷、旱、涝等）。其中已批准进行大面积环境释放和商品化生产应用 的转基因植物主要有大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、番茄、西葫芦、番木瓜等农作物。 我国研究的转基因植物种类 50 多种，涉及各类基因 100 多种（含标记基因）。目前正在研究 开发的转基因园艺植物种类主要有马铃薯、番茄、甜椒、白菜、花生、甜瓜、西瓜、番木瓜、 广霍香等。自 1997 年 3 月至 2000 年 7 月，我国共批准商品化生产 35 项，涉及 4 种作物（棉 花、番茄、甜椒、矮牵牛花）；批准环境释放 81 项（其中涉及番茄、甜椒、马铃薯、黄瓜、 杨树、玉米等作物）。预计全球范围内转基因植物产品市场销售额将由 1996 年不足 5 亿美元
到2010年增至200亿美元。 全球转基因作物种植面积从1996年的约170万公顷猛增到1999年的3990万公顷。美国、 阿根廷和加拿大为转基因农作物的3个主产国，种植面积占全球转基因农作物面积的90%以 上：面积前4位作物为大豆、玉米、棉花、油菜：主要性状为抗除草剂、抗虫：抗除草剂大 豆面积最大。在研究方向上，第一代转基因作物以抗病虫为主，目前第二代转基因作物把培 育品质优良（高维生素、高营养、低脂肪）新品种与高抗病虫害和高产新品种放在同等重要 的位置，许多改善品质和增加营养保健为主要的转基因作物正获准生产或进入产业化开发阶 段。 二、园艺植物基因工程技术要点 植物基因工程技术的主要技术环节是：目的基因的分离与克隆一目的基因的修饰(5’端 加上组成型或诱导性特异启动子，3'端加终止子)→植物表达载体的构建一遗传转化（以 T或Ri质粒、PEG介导的原生质体转化，电激法、基因枪法、脂质体介导、花粉管通道法 等)→转化植物细胞的筛选→植株再生一转基因植株鉴定(PCR,Southern或western杂交， 表型检测)→发放或进一步培育各种新优品种（系）。 1、目的基因分离克隆 基因是编码蛋白质与RNA的一段核苷酸序列。重要性状基因的分离与克隆，是基因工 程的上游技术，也是整个工作的基础与核心。常见的几类重要基因有抗虫基因(Bt基因、蛋 白酶抑制剂基因、植物凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因等)，抗病毒基因(CP基因)，抗真菌 基因（几丁质酶、B-1,3葡聚糖酶基因），抗细菌基因（杀菌肽、溶菌酶基因），抗盐基因 (甜菜碱脱氢酶BADH),品质相关基因（如PG反义基因、ACC合成酶反义基因等），产量 相关基因（如磷酸葡萄糖合成酶基因），以及其它性状基因如甜味基因、花色基因、黄酮类色 素生物合成基因、植物光敏素基因、生长素生物合成基因等。 基因的分离方法建立在基因的4个基本特性上：固定的核苷酸的序列、在染色体占有特 定座位、特定的转录模式、有特定的功能。常见的基因分离方法与策略有以下几类： 基于基因产物（蛋白多肽）的克隆按照中心法则，特定蛋白多肽由特定的基因转录、 翻译产生的，随着高分辨单双向PAGE电泳及其它分离技术发展，分离纯化特异蛋白的技术 日趋成熟。因而多数功能基因的分离克隆可从其编码的蛋白入手。可以从特异蛋白序列入手， 如马铃薯中编码柱头识别蛋白基因、辣根中HRPC基因、胡萝卜体细胞胚发生中受发育调控 的特异性基因的克隆。 基于基因差异表达的克隆高等植物在生长发育衰老等生命活动过程中，不同基因存在 着选择性表达，基于差异表达的特性，利用反向生物学原理，从差异mRNA入手，反转录成 CDNA,最终克隆差异表达的新基因，尤其是发育基因已成为当今研究热点。转录水平差异 表达基因研究方法较多，如差异筛选、差减杂交、mRNA差异显示法(DD-RT-PCR)、代表 性差异分析(DA)等。在研究基因表达、基因的鉴定与克隆、激素对植物发育的影响、植 物的发育过程、次生代谢途径以及抗病抗逆机理方面有着成功的应用，成为当今基因的鉴定 与克隆的重要方法，如番茄TMV抗性基因Tm-2a、成熟相关基因、拟南芥臭氧诱导基因 At0ZI1、马铃薯块茎发育相关基因等。另外还发展了以PCR反应为基础的cDNA差减杂交法 13
13 到 2010 年增至 200 亿美元。 全球转基因作物种植面积从 1996 年的约 170 万公顷猛增到 1999 年的 3990 万公顷。美国、 阿根廷和加拿大为转基因农作物的 3 个主产国，种植面积占全球转基因农作物面积的 90％以 上；面积前 4 位作物为大豆、玉米、棉花、油菜；主要性状为抗除草剂、抗虫；抗除草剂大 豆面积最大。在研究方向上，第一代转基因作物以抗病虫为主，目前第二代转基因作物把培 育品质优良（高维生素、高营养、低脂肪）新品种与高抗病虫害和高产新品种放在同等重要 的位置，许多改善品质和增加营养保健为主要的转基因作物正获准生产或进入产业化开发阶 段。 二、园艺植物基因工程技术要点 植物基因工程技术的主要技术环节是：目的基因的分离与克隆一目的基因的修饰（5′端 加上组成型或诱导性特异启动子，3′端加终止子）→植物表达载体的构建一遗传转化（以 Ti 或 Ri 质粒、PEG 介导的原生质体转化，电激法、基因枪法、脂质体介导、花粉管通道法 等）→转化植物细胞的筛选→植株再生一转基因植株鉴定（PCR, Southern 或 western 杂交， 表型检测）→发放或进一步培育各种新优品种（系）。 1、目的基因分离克隆 基因是编码蛋白质与 RNA 的一段核苷酸序列。重要性状基因的分离与克隆，是基因工 程的上游技术，也是整个工作的基础与核心。常见的几类重要基因有抗虫基因（Bt 基因、蛋 白酶抑制剂基因、植物凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因等），抗病毒基因（CP 基因），抗真菌 基因（几丁质酶、β-1，3 葡聚糖酶基因），抗细菌基因（杀菌肽、溶菌酶基因），抗盐基因 （甜菜碱脱氢酶 BADH），品质相关基因（如 PG 反义基因、ACC 合成酶反义基因等），产量 相关基因（如磷酸葡萄糖合成酶基因），以及其它性状基因如甜味基因、花色基因、黄酮类色 素生物合成基因、植物光敏素基因、生长素生物合成基因等。 基因的分离方法建立在基因的 4 个基本特性上：固定的核苷酸的序列、在染色体占有特 定座位、特定的转录模式、有特定的功能。常见的基因分离方法与策略有以下几类： 基于基因产物（蛋白多肽）的克隆 按照中心法则，特定蛋白多肽由特定的基因转录、 翻译产生的，随着高分辨单双向 PAGE 电泳及其它分离技术发展，分离纯化特异蛋白的技术 日趋成熟。因而多数功能基因的分离克隆可从其编码的蛋白入手。可以从特异蛋白序列入手， 如马铃薯中编码柱头识别蛋白基因、辣根中 HRP-C 基因、胡萝卜体细胞胚发生中受发育调控 的特异性基因的克隆。 基于基因差异表达的克隆 高等植物在生长发育衰老等生命活动过程中，不同基因存在 着选择性表达，基于差异表达的特性，利用反向生物学原理，从差异 mRNA 入手，反转录成 cDNA，最终克隆差异表达的新基因，尤其是发育基因已成为当今研究热点。转录水平差异 表达基因研究方法较多，如差异筛选、差减杂交、mRNA 差异显示法（DD-RT-PCR）、代表 性差异分析（RDA）等。在研究基因表达、基因的鉴定与克隆、激素对植物发育的影响、植 物的发育过程、次生代谢途径以及抗病抗逆机理方面有着成功的应用，成为当今基因的鉴定 与克隆的重要方法，如番茄 TMV 抗性基因 Tm-2a、成熟相关基因、拟南芥臭氧诱导基因 At0ZI1、马铃薯块茎发育相关基因等。另外还发展了以 PCR 反应为基础的 cDNA 差减杂交法
抑制消减杂交法(S$H)以及基于基因芯片的克隆等许多新方法。 基因序列同源克隆主要是依据基因序列同源保守性，从一种生物中分离获得的基因可被 用作探针，来分离另一生物中与之相应的同源基因。主要有两种方法，同源探针筛选法（同 源杂交法)用己知基因的高保守序列指导同源探针制备，以此探针从相应文库中筛出阳性克 隆：序列同源基因的PC分离对基因序列保守区设计数十个核苷酸长的PCR引物，进行 gDNA或CDNA PCR,获得PCR产物，将此产物作分子探针，杂交筛选基因文库即可获得目 的基因克隆。目前己获得许多基因，如荔枝Cu-Zn-SOD基因、菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)、 雪花莲Lectin基因、矮牵牛CHS-A基因等。 基于图谱的基因克隆方法又叫图位克隆技术或染色体步移法。在未知基因的功能信息 且表达产物未知时，此法可成功应用：从理论上讲，可以分离任何一个突变基因。其前提是 具有目的基因遗传图谱、物理图谱，以及含有大片段的染色体DNA文库。基本策略是：目 的基因分子标记精细定位(RFLP、RAPD、AFLP、SSR等)→以紧密连锁的分子标记为起 点→染色体步行→逐步向目的基因靠近→筛选与鉴定候选基因克隆→最终克隆出目的基因。 应用此法Martin(1993)首次成功克隆了番茄PTO基因。 以DNA插入诱变为基础的克隆方法（基因标签法）其基本原理是：将一段已知的外 源DNA作标签，设法插入到染色体上的目的基因中（使日的基因表达受影响→激活或失活）， 产生可筛选的突变表型，再确定突变表型与所插标签连锁（遗传分析），用标签作分子探针， 杂交此突变体的染色体文库，克隆与标签相连的植物DNA(或用反向PCR法)，钓出此DNA 片段后再用作探针杂交野生型染色体文库，最终获得与突变相应的完整的目的基因克隆。此 技术的前提是：有遗传特性明确的标签，可随机插入染色体上不同位置：可将标签插入染色 体中：标签插入后的突变可引起易检测的表型变化。 按诱变因子可分两类：T-DNA标签法和转座子标签法。应用TDNA标签法成功分离到 拟南芥CH-42、LD(开花时间)、EMB30(胚发育)、CTR1(乙烯信号传导)等基因。目前 已在玉米、金鱼草、矮牵牛、大豆、大肠杆菌、酵母、果蝇、线虫、家蚕中发现许多转座子。 在玉米、金鱼草中用转座子标签法克隆到的基因有：A1、BZ2(花色素合成)、VP1(种子发 育)、TS2(花雌雄性)，FLO(花芽分化)、FIM(花形态建成)、以及玉米核恢复基因RF2 等。不但在同种作物中克隆到许多基因而且在异种植物中也开始应用。玉米中AC/DS可在 烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、矮牵牛、水稻中转座。其显著的优点是因本身无转座子，故 转入的转座子将是唯一的突变因子（不必进行紧密连锁的遗传分析），在拟南芥中应用玉米 SPm(En)成功克隆了雄性不育基因MS2,ACDS在矮牵牛中分离到花色合成基因PH6,番 茄中与叶绿体发育有关的基因Xa-1等。 2、植物表达载体的构建 构建植物表达载体就是在目的基因的5'端加上启动子，在基因的3'端加上终止子，以 便使外源基因中有效地表达，充分发挥其功能。构建植物表达载体时，应根据不同的研究目 的选择合适的启动子，如需要目的基因在各个部位、时期都表达，就选用组成型启动子：如 需在特定时间表达应选用发育特异启动子或诱导性特异启动子。植物基因工程最常用的组成 型表达的启动于是从花椰菜花病毒中分离出的35S启动子，其次是胭脂碱和章鱼合成的NOS 启动子和OC$启动子。诱导型特异表达的启动子在植物基因工程中将发挥越来越重要的作
14 ——抑制消减杂交法（SSH）以及基于基因芯片的克隆等许多新方法。 基因序列同源克隆主要是依据基因序列同源保守性，从一种生物中分离获得的基因可被 用作探针，来分离另一生物中与之相应的同源基因。主要有两种方法，同源探针筛选法（同 源杂交法）用已知基因的高保守序列指导同源探针制备，以此探针从相应文库中筛出阳性克 隆；序列同源基因的 PCR 分离对基因序列保守区设计数十个核苷酸长的 PCR 引物，进行 gDNA 或 cDNA PCR，获得 PCR 产物，将此产物作分子探针，杂交筛选基因文库即可获得目 的基因克隆。目前已获得许多基因，如荔枝 Cu-Zn-SOD 基因、菠菜甜菜碱醛脱氢酶（BADH）、 雪花莲 Lectin 基因、矮牵牛 CHS-A 基因等。 基于图谱的基因克隆方法 又叫图位克隆技术或染色体步移法。在未知基因的功能信息 且表达产物未知时，此法可成功应用；从理论上讲，可以分离任何一个突变基因。其前提是 具有目的基因遗传图谱、物理图谱，以及含有大片段的染色体 DNA 文库。基本策略是：目 的基因分子标记精细定位（RFLP、RAPD、AFLP、SSR 等）→以紧密连锁的分子标记为起 点→染色体步行→逐步向目的基因靠近→筛选与鉴定候选基因克隆→最终克隆出目的基因。 应用此法 Martin（1993）首次成功克隆了番茄 PTO 基因。 以 DNA 插入诱变为基础的克隆方法（基因标签法） 其基本原理是：将一段已知的外 源 DNA 作标签，设法插入到染色体上的目的基因中（使目的基因表达受影响→激活或失活）， 产生可筛选的突变表型，再确定突变表型与所插标签连锁（遗传分析），用标签作分子探针， 杂交此突变体的染色体文库，克隆与标签相连的植物 DNA（或用反向 PCR 法），钓出此 DNA 片段后再用作探针杂交野生型染色体文库，最终获得与突变相应的完整的目的基因克隆。此 技术的前提是：有遗传特性明确的标签，可随机插入染色体上不同位置；可将标签插入染色 体中；标签插入后的突变可引起易检测的表型变化。 按诱变因子可分两类：T-DNA 标签法和转座子标签法。应用 T-DNA 标签法成功分离到 拟南芥 CH-42、LD（开花时间）、EMB30（胚发育）、CTR1（乙烯信号传导）等基因。目前 已在玉米、金鱼草、矮牵牛、大豆、大肠杆菌、酵母、果蝇、线虫、家蚕中发现许多转座子。 在玉米、金鱼草中用转座子标签法克隆到的基因有：A1、BZ2（花色素合成）、VP1（种子发 育）、TS2（花雌雄性），FLO（花芽分化）、FIM（花形态建成）、以及玉米核恢复基因 RF2 等。不但在同种作物中克隆到许多基因而且在异种植物中也开始应用。玉米中 AC／DS 可在 烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、矮牵牛、水稻中转座。其显著的优点是因本身无转座子，故 转入的转座子将是唯一的突变因子（不必进行紧密连锁的遗传分析），在拟南芥中应用玉米 SPm（En）成功克隆了雄性不育基因 MS2，AC/DS 在矮牵牛中分离到花色合成基因 PH6，番 茄中与叶绿体发育有关的基因 Xa-1 等。 2、植物表达载体的构建 构建植物表达载体就是在目的基因的 5′端加上启动子，在基因的 3′端加上终止子，以 便使外源基因中有效地表达，充分发挥其功能。构建植物表达载体时，应根据不同的研究目 的选择合适的启动子，如需要目的基因在各个部位、时期都表达，就选用组成型启动子；如 需在特定时间表达应选用发育特异启动子或诱导性特异启动子。植物基因工程最常用的组成 型表达的启动于是从花椰菜花病毒中分离出的 35S 启动子，其次是胭脂碱和章鱼合成的 NOS 启动子和 OCS 启动子。诱导型特异表达的启动子在植物基因工程中将发挥越来越重要的作
用。转录的终止似乎并不重要，目前常用胭脂碱合成的NOS终止子和Rubisco小亚基基因的 3'端区域。 3、遗传转化 植物的遗传转化是指利用生物或物理化学等手段，将外源基因导入植物细胞以获得转基 因植株的技术。植物细胞的遗传转化系统可分为两大类：载体介导转化和DNA直接转化。 载体介导转化将目的基因连接于某一载体DNA上，然后再通过宿主感染受体植物等 途径将外源基因导入植物细胞的技术。应用最主要的是根癌农杆菌T质粒与发根农杆菌R 介导的遗传转化。植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，如乙酰丁香酮和羟基乙 酰丁香酮，它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子，具有趋药性的农杆菌即移向这些细胞， 最终导致T-DNA的转移。根据此特性，发展了叶盘法(Leaf disc)转化系统，即将新切的叶 圆片和农杆菌共培养后，筛选转化细胞，并再生植株。现己在许多双子叶作物上广泛采用， 在水仙、吊兰、唐菖蒲、山药、石蒜、黄花菜、玉米等单子叶植物上也获得成功。 DNA直接转化法通过物理化学法将外源基因转入受体细胞的技术。主要有电激法、基 因枪法、激光微束穿孔法、脂质体介导法、多聚物介导法、花粉管通道法(pollen tube pathway)、 显微注射法、超声波法等。电激法是在适当外加电压作用下，由磷脂双分子层构成的细胞膜 有可能被击穿，但不影响或很少影响细胞质的活动，移去外加电压后，膜孔在一定时间可以 自动修复。利用这一原理，将原生质体与外源基因混合置于电激仪的样品室中，在一定的电 压下进行短时间直流电脉冲，再将原生质体转至培养基中筛选，培养并诱导再生植株。电激 转化法的基础是原生质体的高效再生。 基因枪法的基本原理是将外源DNA与钨、金等金属微粒共同保温，使DNA吸附于金属 颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之直接射入受体植物细胞，外源基因随着金属颗粒进 入细胞内部。此法主要优点是不受受体类型限制，操作迅速、简单、转化频率较高。 4、转化细胞筛选及转基因植株鉴定 植物外植体经过遗传转化，只有部分细胞是被转化的，需要采用特定的方式淘汰未转化 的细胞，使成功转化的细胞再生成转基因植株。 1)转化植物细胞的筛选 目前，主要利用转化载体上携带的显性标记基因（标记基因），多为抗生素抗性与抗除草 剂基因，如NtⅡ基因，使转化体对卡那霉素不敏感。抗生素筛选主要在诱导或分化培养基 上进行，抗除草剂筛选也可在田间进行。 2)转化体鉴定 转化体的鉴定一般包括报告基因检测、DNA/RNA分子鉴定、表达蛋白鉴定、性状鉴定 等。植物基因工程中用来快速简易地区分转基因和非转基因植物，进行转化体初步筛选，以 确定外源基因的导入与否、存在和表达特性的一些基因，如Nos、CAT、Luc和GUS基因等， 称为报告基因。由于GUS基因产物为B葡萄糖苷酶，易于检测，而成为目前植物基因工程 中应用最为广泛的报告基因。GUS检测方法有定性组织化学染色法和定量荧光分光光度计检 测法等。短暂表达表明GUS基因已进入植物细胞。在细胞内酶系统的作用下，GUS基因被 转录翻译成蛋白质B-葡萄糖苷酶，在染色液中加入B-葡萄糖苷酶的底物5-溴-4-氯-3-吲哚 B-D-葡萄糖苷酸酯(X-Gluc),转化细胞中GUS基因表达合成的B.葡萄糖苷就可以使其产 15
15 用。转录的终止似乎并不重要，目前常用胭脂碱合成的 NOS 终止子和 Rubisco 小亚基基因的 3′端区域。 3、遗传转化 植物的遗传转化是指利用生物或物理化学等手段，将外源基因导入植物细胞以获得转基 因植株的技术。植物细胞的遗传转化系统可分为两大类：载体介导转化和 DNA 直接转化。 载体介导转化 将目的基因连接于某一载体 DNA 上，然后再通过宿主感染受体植物等 途径将外源基因导入植物细胞的技术。应用最主要的是根癌农杆菌 Ti 质粒与发根农杆菌 Ri 介导的遗传转化。植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，如乙酰丁香酮和羟基乙 酰丁香酮，它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子，具有趋药性的农杆菌即移向这些细胞， 最终导致 T-DNA 的转移。根据此特性，发展了叶盘法（Leaf disc）转化系统，即将新切的叶 圆片和农杆菌共培养后，筛选转化细胞，并再生植株。现已在许多双子叶作物上广泛采用， 在水仙、吊兰、唐菖蒲、山药、石蒜、黄花菜、玉米等单子叶植物上也获得成功。 DNA 直接转化法 通过物理化学法将外源基因转入受体细胞的技术。主要有电激法、基 因枪法、激光微束穿孔法、脂质体介导法、多聚物介导法、花粉管通道法（pollen tube pathway）、 显微注射法、超声波法等。电激法是在适当外加电压作用下，由磷脂双分子层构成的细胞膜 有可能被击穿，但不影响或很少影响细胞质的活动，移去外加电压后，膜孔在一定时间可以 自动修复。利用这一原理，将原生质体与外源基因混合置于电激仪的样品室中，在一定的电 压下进行短时间直流电脉冲，再将原生质体转至培养基中筛选，培养并诱导再生植株。电激 转化法的基础是原生质体的高效再生。 基因枪法的基本原理是将外源 DNA 与钨、金等金属微粒共同保温，使 DNA 吸附于金属 颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之直接射入受体植物细胞，外源基因随着金属颗粒进 入细胞内部。此法主要优点是不受受体类型限制，操作迅速、简单、转化频率较高。 4、转化细胞筛选及转基因植株鉴定 植物外植体经过遗传转化，只有部分细胞是被转化的，需要采用特定的方式淘汰未转化 的细胞，使成功转化的细胞再生成转基因植株。 1）转化植物细胞的筛选 目前，主要利用转化载体上携带的显性标记基因（标记基因），多为抗生素抗性与抗除草 剂基因，如 Npt II 基因，使转化体对卡那霉素不敏感。抗生素筛选主要在诱导或分化培养基 上进行，抗除草剂筛选也可在田间进行。 2）转化体鉴定 转化体的鉴定一般包括报告基因检测、DNA/RNA 分子鉴定、表达蛋白鉴定、性状鉴定 等。植物基因工程中用来快速简易地区分转基因和非转基因植物，进行转化体初步筛选，以 确定外源基因的导入与否、存在和表达特性的一些基因，如 Nos、CAT、Luc 和 GUS 基因等， 称为报告基因。由于 GUS 基因产物为β-葡萄糖苷酶，易于检测，而成为目前植物基因工程 中应用最为广泛的报告基因。GUS 检测方法有定性组织化学染色法和定量荧光分光光度计检 测法等。短暂表达表明 GUS 基因已进入植物细胞。在细胞内酶系统的作用下，GUS 基因被 转录翻译成蛋白质β-葡萄糖苷酶，在染色液中加入β-葡萄糖苷酶的底物 5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc），转化细胞中 GUS 基因表达合成的β-葡萄糖苷就可以使其产