第九章 生物技术育种 任何园艺作物新品种的培育都要有可利用的遗传变异，而育种工作中又常面临着具有优 良性状的种质材料少、群体大小有限、性状选择效率低、工作量大等困难。因此，培育一个 优良品种所需时间长，即使是一年生蔬菜作物，也要经过许多年才能育成一个新品种，多年 生果树就更长。育种工作者经常试图利用温室加代和南繁来缩短时间以加速育种进程：在群 体大小方面，常常需要在最大的理想群体和经济上许可的现实群体大小之间进行折中。如果 群体太小，将可能会由于遗传漂变等因素影响而丢失理想的基因型。 生物技术(Biotechnology),又称生物工程，是指以现代生命科学为基础，结合先进的工 程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人 类生产出所需产品的技术体系。生物技术是一门新兴的、综合性的学科，涉及微生物学、生 物化学、细胞生物学、免疫学、育种技术等几乎所有与生命科学有关的学科，特别是现代分 子生物学的最新理论成就更是生物技术发展的基础。我国早在1986年初制定的《高技术研究 发展计划纲要》中就将生物技术列于航天技术、信息技术、激光技术、自动化技术等高技术 的首位。专家预计，生物技术将是21世纪高技术革命的核心内容，生物技术产业将是2！世 纪的支柱产业。广义上讲，生物技术包括传统生物技术和现代生物技术两部分。现代生物技 术是指上世纪70年代末80年代初发展起来的，以现代生物学研究成果为基础，以基因工程 为核心的新兴学科。目前所称的生物技术基本上都是指现代生物技术。 根据生物技术操作的对象及操作技术的不同，生物技术主要包括以下5项技术工程：基 因工程（也称DNA重组技术）入、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程（指在基因工程 的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对 基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需 要的新型蛋白质)等。在园艺作物遗传与新品种培育过程中，应用得最多的是细胞工程、基 因工程以及近年来发展的分子标记技术等。人们运用细胞工程进行繁殖新种质、新品种，创 造新种质：通过基因工程手段改进某一或多个重要园艺性状：利用分子标记技术进行品种登 记、纯度鉴定、重要性状位点标记，以提高育种中性状选择效率。本章将简要地介绍现代植 物生物技术基本原理以及在园艺作物育种上的应用。 第一节 细胞工程育种 植物细胞工程指以植物细胞为操纵对象，在体外进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些 生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植 物个体，以获得某种有用物质的过程。主要包括园艺植物离体培养以及以此为基础的细胞融 合技术（也称体细胞杂交技木）、细胞器移植技术、染色体工程、倍性育种等。 一、园艺植物离体培养 (一)植物离体培养的概念
1 第九章 生物技术育种 任何园艺作物新品种的培育都要有可利用的遗传变异，而育种工作中又常面临着具有优 良性状的种质材料少、群体大小有限、性状选择效率低、工作量大等困难。因此，培育一个 优良品种所需时间长，即使是一年生蔬菜作物，也要经过许多年才能育成一个新品种，多年 生果树就更长。育种工作者经常试图利用温室加代和南繁来缩短时间以加速育种进程；在群 体大小方面，常常需要在最大的理想群体和经济上许可的现实群体大小之间进行折中。如果 群体太小，将可能会由于遗传漂变等因素影响而丢失理想的基因型。 生物技术（Biotechnology），又称生物工程，是指以现代生命科学为基础，结合先进的工 程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人 类生产出所需产品的技术体系。生物技术是一门新兴的、综合性的学科，涉及微生物学、生 物化学、细胞生物学、免疫学、育种技术等几乎所有与生命科学有关的学科，特别是现代分 子生物学的最新理论成就更是生物技术发展的基础。我国早在 1986 年初制定的《高技术研究 发展计划纲要》中就将生物技术列于航天技术、信息技术、激光技术、自动化技术等高技术 的首位。专家预计，生物技术将是 2l 世纪高技术革命的核心内容，生物技术产业将是 2l 世 纪的支柱产业。广义上讲，生物技术包括传统生物技术和现代生物技术两部分。现代生物技 术是指上世纪 70 年代末 80 年代初发展起来的，以现代生物学研究成果为基础，以基因工程 为核心的新兴学科。目前所称的生物技术基本上都是指现代生物技术。 根据生物技术操作的对象及操作技术的不同，生物技术主要包括以下 5 项技术工程：基 因工程（也称 DNA 重组技术）、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程（指在基因工程 的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对 基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需 要的新型蛋白质）等。在园艺作物遗传与新品种培育过程中，应用得最多的是细胞工程、基 因工程以及近年来发展的分子标记技术等。人们运用细胞工程进行繁殖新种质、新品种，创 造新种质；通过基因工程手段改进某一或多个重要园艺性状；利用分子标记技术进行品种登 记、纯度鉴定、重要性状位点标记，以提高育种中性状选择效率。本章将简要地介绍现代植 物生物技术基本原理以及在园艺作物育种上的应用。 第一节 细胞工程育种 植物细胞工程指以植物细胞为操纵对象，在体外进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些 生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植 物个体，以获得某种有用物质的过程。主要包括园艺植物离体培养以及以此为基础的细胞融 合技术（也称体细胞杂交技木）、细胞器移植技术、染色体工程、倍性育种等。 一、园艺植物离体培养 （一）植物离体培养的概念
植物离体培养(in vitro culture)即广义的组织培养，是现代生物技术的一个重要组成部 分，它是指运用无菌操作技术，将从植物体分离的符合需要的组织、器官或细胞（包括去壁 后的原生质体)等，接种在人工培养基上，置于人工控制的环境条件下进行培养，以获得再 生的完整植株或生产具有经济价值的其它生物产品的技术。在植物离体培养中，用于接种的 材料叫作外植体(explant)。按照外植体的不同，植物离体培养可以分为： I、胚胎培养(embryo culture)包括成熟胚、幼胚、胚珠、子房培养以及试管受精等。 2、器官培养(organ culture)包括根尖、茎尖、子叶、叶原基、花原基、未成熟的花器 官各部分以及未成熟的果实培养。 3、组织或愈伤组织培养(tissue or callus culture) 此处的组织培养为狭义的，即植物各 部分的组织，如维管形成层、贮藏薄壁组织、根的中柱鞘、叶肉、胚乳以及维管束原等组织 的一小片段，接种培养。 4、细胞培养(cell culture)利用能保持良好分散性的离体细胞或很小的细胞团进行液体 培养或悬浮培养(suspension culture)。 5、原生质体培养(protoplast culture)即对利用酶解法除去细胞壁后的活原生质体进行 培养。 按照所用培养基固化与否，组织培养又可以分为液体培养和固体培养两种方法。液体培 养又分为静置培养和振荡培养。外植体在固体培养基上的培养叫固体培养。固体培养基即在 液体培养基中加入0.51.2%的琼脂使液体培养基固化，一般pH调至5.4~5.8。固体培养的缺 点是外植体只有一部分接触培养基，不能全部浸没在培养基中，结果培养物上、下部因接受 养分不均匀而形成差异，不易使细胞群均一：液体培养的缺点主要是通气不良，应将盛有培 养物和液体培养基的器皿置于转床或摇床上进行振荡培养，以使培养材料在培养基中均匀地 接触到培养基，又保持良好的通气状况。 (二)植物离体培养的基本原理 1.植物细胞全能性及其表达 植物离体培养的理论基础是细胞的全能性(totipotence)学说。植物细胞全能性是指植物 的每个细跑都具有该物种的全部遗传信息，离体细胞在一定的培养条件下具有发育成完整植 株的潜在能力。自然情况下，雌雄配子经过受精作用结合成合子，再完成自然的脱分化过程， 成为具有全能性的分生细胞，合子经过一系列的有丝分裂分化形成具有一定形态、结构与机 能的植株。由于在个体发育过程中，细胞受到严格的发育周期调控，在特定的器官表现出 定的形态、行使一定的功能，但其遗传全能性并没有丧失，因此，一旦脱离原来的组织或器 官成为离体状态，在一定的培养条件下，就可以经脱分化而恢复其全能性，由单细胞或小细 胞团发育成愈伤组织或胚状体，进一步分化形成再生植株。 实现全能性，必须经历两个重要过程：(1)脱分化将植物体分化组织中已停止分化的 细胞在离体条件下，使其从分化状态转变为分生状态，恢复细胞的分裂活性。愈伤组织实际 上就是一种典型的脱分化组织。(2)再分化脱分化的细胞或组织在一定的培养条件下，产 生各种不同类型的分化细胞，这一过程称为再分化。在脱分化和再生过程个，细胞的全能性 得以表达。当然，不同植物、不同的组织器官、不同细胞间全能性表达的程度会有所不同， 这主要取决于细胞所处的发育状态和生理状态
2 植物离体培养（in vitro culture）即广义的组织培养，是现代生物技术的一个重要组成部 分，它是指运用无菌操作技术，将从植物体分离的符合需要的组织、器官或细胞（包括去壁 后的原生质体）等，接种在人工培养基上，置于人工控制的环境条件下进行培养，以获得再 生的完整植株或生产具有经济价值的其它生物产品的技术。在植物离体培养中，用于接种的 材料叫作外植体（explant）。按照外植体的不同，植物离体培养可以分为： 1、胚胎培养（embryo culture）包括成熟胚、幼胚、胚珠、子房培养以及试管受精等。 2、器官培养（organ culture）包括根尖、茎尖、子叶、叶原基、花原基、未成熟的花器 官各部分以及未成熟的果实培养。 3、组织或愈伤组织培养（tissue or callus culture） 此处的组织培养为狭义的，即植物各 部分的组织，如维管形成层、贮藏薄壁组织、根的中柱鞘、叶肉、胚乳以及维管束原等组织 的一小片段，接种培养。 4、细胞培养（cell culture）利用能保持良好分散性的离体细胞或很小的细胞团进行液体 培养或悬浮培养（suspension culture）。 5、原生质体培养（protoplast culture）即对利用酶解法除去细胞壁后的活原生质体进行 培养。 按照所用培养基固化与否，组织培养又可以分为液体培养和固体培养两种方法。液体培 养又分为静置培养和振荡培养。外植体在固体培养基上的培养叫固体培养。固体培养基即在 液体培养基中加入 0.5~1.2％的琼脂使液体培养基固化，一般 pH 调至 5.4~5.8。固体培养的缺 点是外植体只有一部分接触培养基，不能全部浸没在培养基中，结果培养物上、下部因接受 养分不均匀而形成差异，不易使细胞群均一；液体培养的缺点主要是通气不良，应将盛有培 养物和液体培养基的器皿置于转床或摇床上进行振荡培养，以使培养材料在培养基中均匀地 接触到培养基，又保持良好的通气状况。 （二）植物离体培养的基本原理 1．植物细胞全能性及其表达 植物离体培养的理论基础是细胞的全能性（totipotence）学说。植物细胞全能性是指植物 的每个细跑都具有该物种的全部遗传信息，离体细胞在一定的培养条件下具有发育成完整植 株的潜在能力。自然情况下，雌雄配子经过受精作用结合成合子，再完成自然的脱分化过程， 成为具有全能性的分生细胞，合子经过一系列的有丝分裂分化形成具有一定形态、结构与机 能的植株。由于在个体发育过程中，细胞受到严格的发育周期调控，在特定的器官表现出一 定的形态、行使一定的功能，但其遗传全能性并没有丧失，因此，一旦脱离原来的组织或器 官成为离体状态，在一定的培养条件下，就可以经脱分化而恢复其全能性，由单细胞或小细 胞团发育成愈伤组织或胚状体，进一步分化形成再生植株。 实现全能性，必须经历两个重要过程：（1）脱分化 将植物体分化组织中已停止分化的 细胞在离体条件下，使其从分化状态转变为分生状态，恢复细胞的分裂活性。愈伤组织实际 上就是一种典型的脱分化组织。（2）再分化 脱分化的细胞或组织在一定的培养条件下，产 生各种不同类型的分化细胞，这一过程称为再分化。在脱分化和再生过程个，细胞的全能性 得以表达。当然，不同植物、不同的组织器官、不同细胞间全能性表达的程度会有所不同， 这主要取决于细胞所处的发育状态和生理状态
2.愈伤组织的诱导、增殖和形态建成 在绝大多数情况下植物细胞全能性的表达都要经过一个从分化状态到脱分化的愈伤组织 (或悬浮细胞)的中间阶段，然后进行再分化，当然有时再分化可以直接发生在分化的细胞 当中，而不经历愈伤组织这一中间形式。 1)愈伤组织的诱导 愈伤组织(callus)是指植物细胞经过脱分化不断增殖形成的不定型薄壁细胞组织。在离 体培养条件下，从外植体到形成愈伤组织的过程可以分为三个时期： (1)诱导期 外植体细胞在特定的诱导条件下，改变了原来的发育途径，失去原有的生理功能和形态， 合成代谢旺盛，迅速进行蛋白质和核酸的合成，为细胞分裂淮备条件。诱导期的长短因植物 种类和外植体的生理状态以及外部因素而异，如刚收获的菊芋诱导期只要1天，而贮藏5个 月后，诱导期则要2天，胡萝卜需要好几天。 (2)分裂期 外植体外层细胞开始细胞分裂，由于细胞的迅速分裂使细胞体积变小逐渐回复到分生组 织状态。这一时期的特点是细胞分裂快，细胞体积小，细胞核大，细胞质稠密，液泡小而少， 随着培养组织的不断生长和细胞分裂，逐渐形成肉眼可见的呈球状颗粒的愈伤组织。外植体 脱分化的难易程度因外植体种类、器官及生理状态而有很大的差异。茎、叶等营养器官较难 脱分化，幼嫩组织较成熟的组织易脱分化。 (3)形成期 随着愈伤组织的进一步发育，外层细胞的分裂速度逐渐减慢，细胞分裂从愈伤组织的周 缘细胞转向内部细胞。形成期的愈伤组织外表呈现出瘤状结构，同时内部发生分化，产生呈 分散的节状和短束结构的维管组织，但不形成维管系统。 愈伤组织虽然从形态变化上可人为的划分为三个时期，但实际上各个时期的界限并不严 格，处于不同时期（尤其是分裂期和形成期）的细胞往往共存于同一块愈伤组织中。 2)愈伤组织的继代 新鲜的愈伤组织一般生长旺盛，有光泽，呈奶黄色或白色，也有显淡绿色的，经过一段 时间的生长后，由于培养基中水分、养分的耗失以及代谢产物积累的毒害作用，愈伤组织块 生长速度变慢、趋于老化，变为黄褐色。因此，愈伤组织经诱导形成后，大多需要进行继代 培养以保持愈伤组织旺盛的生长状态，同时增殖形成大量愈伤组织块。继代培养(subculture) 即将原来的愈伤组织分割为小块转移到新鲜培养基上。通常，用于继代的愈伤组织必须达到 一定的大小（直径5~10mm,重量约100mg),否则难以迅速恢复分裂和生长。在正常情况下， 继代后的愈伤组织在3~7天内即可恢复生长，在随后的2~3周处于旺盛生长时期。进行再次 继代培养的合适时期就是愈伤组织生长即将达到顶峰之前，这时继代较容易进入分裂生长。 3)愈伤组织的形态建成 所谓形态建成是指无定形的愈伤组织再分化，形成根和芽，最后获得完整再生植株的过 程。愈伤组织细胞分裂以无规则方式发生，此时虽然也发生了细胞的分化，形成不同的细胞 类型，如薄壁细胞、分生组织细胞、导管和管胞、纤维细胞、石细胞及色素细胞等，但并不 无器官发生，只有在适当的培养条件下，愈伤组织才可发生再分化，形成完整植株。愈伤组 2
3 2．愈伤组织的诱导、增殖和形态建成 在绝大多数情况下植物细胞全能性的表达都要经过一个从分化状态到脱分化的愈伤组织 （或悬浮细胞）的中间阶段，然后进行再分化，当然有时再分化可以直接发生在分化的细胞 当中，而不经历愈伤组织这一中间形式。 1）愈伤组织的诱导 愈伤组织（callus）是指植物细胞经过脱分化不断增殖形成的不定型薄壁细胞组织。在离 体培养条件下，从外植体到形成愈伤组织的过程可以分为三个时期： （1）诱导期 外植体细胞在特定的诱导条件下，改变了原来的发育途径，失去原有的生理功能和形态， 合成代谢旺盛，迅速进行蛋白质和核酸的合成，为细胞分裂淮备条件。诱导期的长短因植物 种类和外植体的生理状态以及外部因素而异，如刚收获的菊芋诱导期只要 1 天，而贮藏 5 个 月后，诱导期则要 2 天，胡萝卜需要好几天。 （2）分裂期 外植体外层细胞开始细胞分裂，由于细胞的迅速分裂使细胞体积变小逐渐回复到分生组 织状态。这一时期的特点是细胞分裂快，细胞体积小，细胞核大，细胞质稠密，液泡小而少， 随着培养组织的不断生长和细胞分裂，逐渐形成肉眼可见的呈球状颗粒的愈伤组织。外植体 脱分化的难易程度因外植体种类、器官及生理状态而有很大的差异。茎、叶等营养器官较难 脱分化，幼嫩组织较成熟的组织易脱分化。 （3）形成期 随着愈伤组织的进一步发育，外层细胞的分裂速度逐渐减慢，细胞分裂从愈伤组织的周 缘细胞转向内部细胞。形成期的愈伤组织外表呈现出瘤状结构，同时内部发生分化，产生呈 分散的节状和短束结构的维管组织，但不形成维管系统。 愈伤组织虽然从形态变化上可人为的划分为三个时期，但实际上各个时期的界限并不严 格，处于不同时期（尤其是分裂期和形成期）的细胞往往共存于同一块愈伤组织中。 2）愈伤组织的继代 新鲜的愈伤组织一般生长旺盛，有光泽，呈奶黄色或白色，也有显淡绿色的，经过一段 时间的生长后，由于培养基中水分、养分的耗失以及代谢产物积累的毒害作用，愈伤组织块 生长速度变慢、趋于老化，变为黄褐色。因此，愈伤组织经诱导形成后，大多需要进行继代 培养以保持愈伤组织旺盛的生长状态，同时增殖形成大量愈伤组织块。继代培养（subculture） 即将原来的愈伤组织分割为小块转移到新鲜培养基上。通常，用于继代的愈伤组织必须达到 一定的大小（直径 5~10mm，重量约 100mg），否则难以迅速恢复分裂和生长。在正常情况下， 继代后的愈伤组织在 3~7 天内即可恢复生长，在随后的 2~3 周处于旺盛生长时期。进行再次 继代培养的合适时期就是愈伤组织生长即将达到顶峰之前，这时继代较容易进入分裂生长。 3）愈伤组织的形态建成 所谓形态建成是指无定形的愈伤组织再分化，形成根和芽，最后获得完整再生植株的过 程。愈伤组织细胞分裂以无规则方式发生，此时虽然也发生了细胞的分化，形成不同的细胞 类型，如薄壁细胞、分生组织细胞、导管和管胞、纤维细胞、石细胞及色素细胞等，但并不 无器官发生，只有在适当的培养条件下，愈伤组织才可发生再分化，形成完整植株。愈伤组
织的再分化有两种发育途径：器官发生和体细胞胚胎发生途径。 (1)器官发生(organogenesis) 器官发生是指离体培养的组织、细胞在诱导条件下分裂和增殖再分化，形成根和芽的过 程。器官发生包括由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等外植体直接分化成器官的直接发生， 以及外植体先脱分化形成愈伤组织后再分化形成器官的间接发生。器官发生是单极性的，器 官（根或芽）里面长出原形成层束，与原先存在于愈伤组织或外植体中的维管组织连接在一 起，成为器官发育的营养运输通道。愈伤组织的器官发生的顺序有4种类型：先形成芽，芽 伸长后在其基部长出根，再生成小植株，多数植物属这种类型：先形成根，再从根的基部分 化出芽形成小植株，在双子叶植物中较普遍：在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，二者 结合起来再生植株，但此时根和芽的维管束一定要相连，再生植株才能成活：仅有根或芽器 官的分别再生，形成无芽的根或无根的苗。 (2)体细胞胚发生(somatic embryogenesis) 体细胞胚发生是指体细胞在未经性细胞融合（受精）的情况下，类似有性合子胚胎发生 的各个阶段而发育成新个体的形态发生过程。由愈伤组织的类薄壁细胞不经过有性过程而直 接产生类似胚的结构，称之为胚状体(embyoid)。胚状体的最根本特征是具有双极性，即在 发育早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，胚根的顶端是封闭的，与母体愈伤组织 或外植体无维管束相连，其维管组织的分布是独立的“Y”字形。 胚状体的诱导和形成可以分为直接产生和间接产生两种方式。直接产生是指外植体中原 先就存在的胚性细胞在进入培养之后直接进入体细胞胚胎发生而形成胚状体，在培养前就存 在的胚性细胞被称为前决定的胚性细胞，如某些植物外植体（下胚轴、子叶或幼花序等）的 表皮细胞中的胚性细胞可以直接产生胚状体：间接发生是通过外植体中己分化细胞的发育方 向的重决定过程诱导出胚性细胞，然后由这些诱导的胚性细胞发育成胚状体。这两种形成方 式的最主要的区别在于后者要经历愈伤组织培养的中间阶段。 (三)影响离体培养的因素 外植体选择、培养基和培养条件是影响离体培养成功的三大重要因素。 1)外植体 理论上，任何外植体在合适的条件下均可脱分化形成愈伤组织，但在实践中外植体的再 生与供体的植物种类、基因型以及外植体本身的生理生化状态密切相关。一般来说带薄壁细 胞及分生细胞的组织较易诱导出愈伤组织。通常外植体幼嫩的、愈伤组织继代次数少，愈伤 组织的再生能力较强。 2)培养基 培养基(medium)为外植体生长提供营养物质。通常分为完全培养基与基本培养基两类。 基本培养基含有大量元素、微量元素、维生素、氨基酸、糖、水等，常见的种类有MS、White、 Nitsh、N6、B5等：完全培养基是在基本培养基上加一些生长调节物质，如BA、2,4-D、IAA、 ZT等，以及一些天然提取物，如椰乳、酵母提取物等。在试验前具体选择培养基时则要考虑 外植体本身的生理状态和试验目的，最佳配方往往要通过试验对比以及试验者的经验来确定。 植物生长调节物质在培养中起着重要的调控作用。诱导和保持愈伤组织生长所需的植物 生长调节物质、种类、激素配比与供体植物的种类、基因型等密切相关。植物生长调节物质
4 织的再分化有两种发育途径：器官发生和体细胞胚胎发生途径。 （1）器官发生（organogenesis） 器官发生是指离体培养的组织、细胞在诱导条件下分裂和增殖再分化，形成根和芽的过 程。器官发生包括由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等外植体直接分化成器官的直接发生， 以及外植体先脱分化形成愈伤组织后再分化形成器官的间接发生。器官发生是单极性的，器 官（根或芽）里面长出原形成层束，与原先存在于愈伤组织或外植体中的维管组织连接在一 起，成为器官发育的营养运输通道。愈伤组织的器官发生的顺序有 4 种类型：先形成芽，芽 伸长后在其基部长出根，再生成小植株，多数植物属这种类型；先形成根，再从根的基部分 化出芽形成小植株，在双子叶植物中较普遍；在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，二者 结合起来再生植株，但此时根和芽的维管束一定要相连，再生植株才能成活；仅有根或芽器 官的分别再生，形成无芽的根或无根的苗。 （2）体细胞胚发生（somatic embryogenesis） 体细胞胚发生是指体细胞在未经性细胞融合（受精）的情况下，类似有性合子胚胎发生 的各个阶段而发育成新个体的形态发生过程。由愈伤组织的类薄壁细胞不经过有性过程而直 接产生类似胚的结构，称之为胚状体（embyoid）。胚状体的最根本特征是具有双极性，即在 发育早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，胚根的顶端是封闭的，与母体愈伤组织 或外植体无维管束相连，其维管组织的分布是独立的“Y”字形。 胚状体的诱导和形成可以分为直接产生和间接产生两种方式。直接产生是指外植体中原 先就存在的胚性细胞在进入培养之后直接进入体细胞胚胎发生而形成胚状体，在培养前就存 在的胚性细胞被称为前决定的胚性细胞，如某些植物外植体（下胚轴、子叶或幼花序等）的 表皮细胞中的胚性细胞可以直接产生胚状体；间接发生是通过外植体中已分化细胞的发育方 向的重决定过程诱导出胚性细胞，然后由这些诱导的胚性细胞发育成胚状体。这两种形成方 式的最主要的区别在于后者要经历愈伤组织培养的中间阶段。 （三）影响离体培养的因素 外植体选择、培养基和培养条件是影响离体培养成功的三大重要因素。 1）外植体 理论上，任何外植体在合适的条件下均可脱分化形成愈伤组织，但在实践中外植体的再 生与供体的植物种类、基因型以及外植体本身的生理生化状态密切相关。一般来说带薄壁细 胞及分生细胞的组织较易诱导出愈伤组织。通常外植体幼嫩的、愈伤组织继代次数少，愈伤 组织的再生能力较强。 2）培养基 培养基（medium）为外植体生长提供营养物质。通常分为完全培养基与基本培养基两类。 基本培养基含有大量元素、微量元素、维生素、氨基酸、糖、水等，常见的种类有 MS、White、 Nitsh、N6、B5 等；完全培养基是在基本培养基上加一些生长调节物质，如 BA、2,4-D、IAA、 ZT 等，以及一些天然提取物，如椰乳、酵母提取物等。在试验前具体选择培养基时则要考虑 外植体本身的生理状态和试验目的，最佳配方往往要通过试验对比以及试验者的经验来确定。 植物生长调节物质在培养中起着重要的调控作用。诱导和保持愈伤组织生长所需的植物 生长调节物质、种类、激素配比与供体植物的种类、基因型等密切相关。植物生长调节物质
对愈伤组织的形态建成起着重要作用。大多数植物，特别是双子叶植物的组织或器官再生符 合经典器官分化模式，即在一定浓度范围内，当生长素细胞分裂素的比例高时易形成根，反 之促进芽的分化，两种激素比例适中时则可促进愈伤组织的生长。对胚状体分化的研究发现， 2,4-D可有效诱导外植体形成愈伤组织并促进愈伤组织内分化出胚性细胞团，但如果愈伤组 织持续地培养在含有高浓度的2,4-D的培养基个，胚性细胞团的进一步发育就会受到抑制， 不能形成正常的胚状体。因此，为了促进愈伤组织的分化，要继代培养时，应降低或去掉2,4-D。 另外，培养基的渗透压是影响愈伤组织形成和分化的一个重要因素，通常以糖类、无机 盐、甘露醇或较高分子量PEG等来维持培养基的渗透压。一般来说，高的渗透压对愈伤组织 的增殖不利。在培养基中加入一些惰性物质，如活性炭等，对愈伤组织的分化有时起促进作 用，有利于愈伤组织的器官发生和体细胞胚胎的发生。 3)培养条件 (1)温度用于愈伤组织诱导及其增殖的温度一般在25±2℃，但其最适温度却有差异， 例如甜菜叶片外植体在31℃培养比25℃时产生的愈伤组织要多，但其形态建成以25℃为最 适，热带园艺植物可控制在30℃左右，形成的体细胞胚和芽较多。低温处理有时可促进分化， 如天竺葵植株10C℃处理可明显提高茎尖培养的诱导率与增殖率。形成愈伤组织的最适温度 还因光照的有无而变化，例如在暗培养条件下，胡萝卜愈伤组织培养的最适温度是26℃，但 在光培养条件下是33℃。一般适合愈伤组织分化的温度为2428℃，温度高低对器官发生的 数量和质量有影响，但不同物种之间最适温度有些差异。 (2)光照光照对愈伤组织的生长有促进作用，有时也有抑制作用。光的作用反映在光 照时间、照光方式、光照强度和光质上，光的作用还受其它培养条件的影响，如培养温度、 培养基中生长调节剂的种类和浓度等。在愈伤组织形态建成阶段，各种植物组织培养的器官 分化对光的要求也各不同，如荷兰芹的器官发生不需要光，天竺葵的愈伤组织以15~16h光 照时产生芽最多，百合原球茎在黑暗条件下长出小球茎，在光照条件下长出叶片。一般植物 组织培养控制在1000-5000Lx的条件下培养。 (四）离体培养技术在园艺作物育种上的应用 1、进行种质创新 1)克服远缘杂交障碍获得远缘杂种 种质资源的利用范围，将一些作物野生种的有用基因转移到栽培作物上来，或把其他属、 种上的有用基因或性状转移到另一个属、种的作物上来，远缘杂交己是植物育种的一项重要 技术。远缘杂种的获得有许多困难，如杂交不亲和性(cross-imcompatibility)、杂种不育性 (hybrid invability)、杂种不稔性(hybrid infertility)等。利用胚珠和子房培养，进行试管授 粉和受精，可以克服由于柱头或花柱等障碍所造成的杂交不亲和性。另外，许多远缘杂交的 失败，往往是由于幼胚的早期败育所致。如在无菌条件下进行幼胚剥离和胚拯救(embyo resure),使其继续发育，即可获得真正的远缘杂种。 2)获得体细胞杂种(somatic hybrid) 近年来，有许多通过原生质体融合来产生体细胞超远缘杂种的报道。体细胞杂交除了获 得通过有性杂交不能获得的属间或种间杂种外，还可作为转移胞质遗传性状（如雄性不育性） 以及非豆科作物转移固氮基因，或高光合效率的基因转移
5 对愈伤组织的形态建成起着重要作用。大多数植物，特别是双子叶植物的组织或器官再生符 合经典器官分化模式，即在一定浓度范围内，当生长素/细胞分裂素的比例高时易形成根，反 之促进芽的分化，两种激素比例适中时则可促进愈伤组织的生长。对胚状体分化的研究发现， 2,4-D 可有效诱导外植体形成愈伤组织并促进愈伤组织内分化出胚性细胞团，但如果愈伤组 织持续地培养在含有高浓度的 2,4-D 的培养基个，胚性细胞团的进一步发育就会受到抑制， 不能形成正常的胚状体。因此，为了促进愈伤组织的分化，要继代培养时，应降低或去掉 2,4-D。 另外，培养基的渗透压是影响愈伤组织形成和分化的一个重要因素，通常以糖类、无机 盐、甘露醇或较高分子量 PEG 等来维持培养基的渗透压。一般来说，高的渗透压对愈伤组织 的增殖不利。在培养基中加入一些惰性物质，如活性炭等，对愈伤组织的分化有时起促进作 用，有利于愈伤组织的器官发生和体细胞胚胎的发生。 3）培养条件 （1）温度 用于愈伤组织诱导及其增殖的温度一般在 25±2℃，但其最适温度却有差异， 例如甜菜叶片外植体在 31℃培养比 25℃时产生的愈伤组织要多，但其形态建成以 25℃为最 适，热带园艺植物可控制在 30℃左右，形成的体细胞胚和芽较多。低温处理有时可促进分化， 如天竺葵植株 10C℃处理可明显提高茎尖培养的诱导率与增殖率。形成愈伤组织的最适温度 还因光照的有无而变化，例如在暗培养条件下，胡萝卜愈伤组织培养的最适温度是 26℃，但 在光培养条件下是 33℃。一般适合愈伤组织分化的温度为 24~28℃，温度高低对器官发生的 数量和质量有影响，但不同物种之间最适温度有些差异。 （2）光照 光照对愈伤组织的生长有促进作用，有时也有抑制作用。光的作用反映在光 照时间、照光方式、光照强度和光质上，光的作用还受其它培养条件的影响，如培养温度、 培养基中生长调节剂的种类和浓度等。在愈伤组织形态建成阶段，各种植物组织培养的器官 分化对光的要求也各不同，如荷兰芹的器官发生不需要光，天竺葵的愈伤组织以 15~16h 光 照时产生芽最多，百合原球茎在黑暗条件下长出小球茎，在光照条件下长出叶片。一般植物 组织培养控制在 1000~5000 Lx 的条件下培养。 （四）离体培养技术在园艺作物育种上的应用 1、进行种质创新 1）克服远缘杂交障碍获得远缘杂种 种质资源的利用范围，将一些作物野生种的有用基因转移到栽培作物上来，或把其他属、 种上的有用基因或性状转移到另一个属、种的作物上来，远缘杂交已是植物育种的一项重要 技术。远缘杂种的获得有许多困难，如杂交不亲和性（cross-imcompatibility）、杂种不育性 （hybrid invability）、杂种不稔性（hybrid infertility）等。利用胚珠和子房培养，进行试管授 粉和受精，可以克服由于柱头或花柱等障碍所造成的杂交不亲和性。另外，许多远缘杂交的 失败，往往是由于幼胚的早期败育所致。如在无菌条件下进行幼胚剥离和胚拯救（embyo resure），使其继续发育，即可获得真正的远缘杂种。 2）获得体细胞杂种（somatic hybrid） 近年来，有许多通过原生质体融合来产生体细胞超远缘杂种的报道。体细胞杂交除了获 得通过有性杂交不能获得的属间或种间杂种外，还可作为转移胞质遗传性状（如雄性不育性） 以及非豆科作物转移固氮基因，或高光合效率的基因转移