3)突变诱发与体细胞无性系筛选 在突变育种中，常常由于产生的突变缺乏专化性而降低其效率，需要在大量的植株中筛 选有利变异，如果在细胞培养过程中，特别是利用单倍体细胞进行诱变，则隐性突变也不会 被其相应的显性基因所遮掩，在一个试管内便可进行大量的细胞筛选，由单个变异了的细胞 再生成完整植株也就不会产生嵌合体。 近年来，体细胞无性系变异(somaclonal variation)己成为选择有用变异的一个新的重要 来源。为了筛选出特殊的突变类型，可以把某种选择因素结合到培养基或环境个进行筛选。 通过这一途径，业已分离出广谱的变异细胞系，如抗药物、抗除草剂、抗病、抗不良环境条 件细胞系，从而成功进行离体选择。 4)遗传转化受体系统 进行高效遗传转化的前提是建立良好的离体再生系统。以原生质体或愈伤组织作为受体 进行遗传转化，培养出转基因植株，在作物改良上具有巨大的潜力，可以提高作物产量，改 良品质，增强作物抗性以及对环境胁迫的耐性。 2、促进倍性育种 利用花药及花粉培养进行单倍体育种，将优良的单倍体进行染色体加倍，便可迅速地获 得纯合的二倍体，从而加速亲本材料的纯化。三倍体植物也可通过胚乳培养再生植株的途径 获得。 3、优良亲本的快繁与资源保存 1)快速繁殖对于优良单株、自交不亲和系、雄性不育系以及常规无性繁殖困难的作物 均可通过组织培养快速形成无性繁殖系。我国已成功建立多种作物的试管苗繁殖技术，其个 主要园艺作物有草莓、石刁柏、马铃薯、大蒜、花椰菜、黄花菜、甘蓝、油菜、黄瓜、胡萝 卜、不结球白菜、大白菜、樱桃等。这种繁殖的特点是不受季节和气候的限制，周年均可进 行，繁殖系数可远远超过常规的有性或无性繁殖。 2)获得脱毒苗对于无性繁殖作物感染病毒引起退化的品种可以通过分生组织培养或再 结合其它处理，有效地进行脱毒，从而获得了脱毒苗。这在马铃薯、大蒜、草莓、甘薯等蔬 菜作物上均有成功的报道。为了防止脱毒种苗（薯）二次感染，建立了种苗圃、二级种苗圃、 生产圃的工厂化生产模式。 3)种质资源试管保存利用茎尖培养结合低温或超低温冷冻贮藏来保存种质资源，特别 是对一些无性繁殖作物的种质资源保存更有价值。它不仅节约空间，又可减少病虫为害，也 便于运输利种质资源的交换。 二、组织和器官培养 组织和器官培养是植物离体培养中研究最早而且应用较广泛。 (一)组织培养基本过程 组织培养的全过程可划分为四个阶段。 第一阶段：无菌培养体系的建立。其目的是建立供试植物的无菌培养。选取适当外植体 与合适的培养基，培养的结果是获得增大了的新梢，生了根的新梢尖或愈伤组织等。只要培 养无明显的污染，接种的外植体中有适当比率的存活并继续较快地生长，就算达到了目的。 6
6 3）突变诱发与体细胞无性系筛选 在突变育种中，常常由于产生的突变缺乏专化性而降低其效率，需要在大量的植株中筛 选有利变异，如果在细胞培养过程中，特别是利用单倍体细胞进行诱变，则隐性突变也不会 被其相应的显性基因所遮掩，在一个试管内便可进行大量的细胞筛选，由单个变异了的细胞 再生成完整植株也就不会产生嵌合体。 近年来，体细胞无性系变异（somaclonal variation）已成为选择有用变异的一个新的重要 来源。为了筛选出特殊的突变类型，可以把某种选择因素结合到培养基或环境个进行筛选。 通过这一途径，业已分离出广谱的变异细胞系，如抗药物、抗除草剂、抗病、抗不良环境条 件细胞系，从而成功进行离体选择。 4）遗传转化受体系统 进行高效遗传转化的前提是建立良好的离体再生系统。以原生质体或愈伤组织作为受体 进行遗传转化，培养出转基因植株，在作物改良上具有巨大的潜力，可以提高作物产量，改 良品质，增强作物抗性以及对环境胁迫的耐性。 2、促进倍性育种 利用花药及花粉培养进行单倍体育种，将优良的单倍体进行染色体加倍，便可迅速地获 得纯合的二倍体，从而加速亲本材料的纯化。三倍体植物也可通过胚乳培养再生植株的途径 获得。 3、优良亲本的快繁与资源保存 1）快速繁殖 对于优良单株、自交不亲和系、雄性不育系以及常规无性繁殖困难的作物 均可通过组织培养快速形成无性繁殖系。我国已成功建立多种作物的试管苗繁殖技术，其个 主要园艺作物有草莓、石刁柏、马铃薯、大蒜、花椰菜、黄花菜、甘蓝、油菜、黄瓜、胡萝 卜、不结球白菜、大白菜、樱桃等。这种繁殖的特点是不受季节和气候的限制，周年均可进 行，繁殖系数可远远超过常规的有性或无性繁殖。 2）获得脱毒苗 对于无性繁殖作物感染病毒引起退化的品种可以通过分生组织培养或再 结合其它处理，有效地进行脱毒，从而获得了脱毒苗。这在马铃薯、大蒜、草莓、甘薯等蔬 菜作物上均有成功的报道。为了防止脱毒种苗（薯）二次感染，建立了种苗圃、二级种苗圃、 生产圃的工厂化生产模式。 3）种质资源试管保存 利用茎尖培养结合低温或超低温冷冻贮藏来保存种质资源，特别 是对一些无性繁殖作物的种质资源保存更有价值。它不仅节约空间，又可减少病虫为害，也 便于运输利种质资源的交换。 二、组织和器官培养 组织和器官培养是植物离体培养中研究最早而且应用较广泛。 （一）组织培养基本过程 组织培养的全过程可划分为四个阶段。 第一阶段：无菌培养体系的建立。其目的是建立供试植物的无菌培养。选取适当外植体 与合适的培养基，培养的结果是获得增大了的新梢，生了根的新梢尖或愈伤组织等。只要培 养无明显的污染，接种的外植体中有适当比率的存活并继续较快地生长，就算达到了目的
第二阶段：营养繁殖体(propagule)的增殖。本阶段主要通过诱导腋芽和顶芽的发生、 或诱导产生不定新梢或诱导体细胞胚胎发生来产生最大量的繁殖体单位。 第三阶段：生根。将第二阶段获得的繁殖体接种在生根培养基上促使其生根。可通过在 培养基中增加一些促进生根的激素类物质，或将新梢接种在基本培养基上或者扦插在人工介 质自然生根，同时进行驯化。 第四阶段：植株定植入土。本阶段主要是保证最大的存活率，以便再生植株投入利用。 在定植入土的开始阶段，必须尽量注意保湿以提高成活率。 (二)茎尖及分生组织培养 茎尖培养(shoot tip culture)与分生组织培养(meristem culture)都需要无菌操作，切取 带有生长点的茎尖进行培养。两种类型的差别，主要在于接种外植体的大小，分生组织培养 的外植体一般仅限于分生组织或带有1~2个叶原基的分生组织，常小于0.5mm,而茎尖培养 的外植体则往往在0.5~5mm,还有切取1~3cm长的茎尖进行培养的。外植体愈大愈易切取， 存活率也更高一些，但太大难以进行脱毒。 茎尖培养和分生组织培养是两种重要的组织培养技术，广泛应用于一些具有较高经济价 值、且繁殖较为困难的园艺植物的快速无性繁殖，如兰花(Cymbium)的快速繁殖，据估计， 利用组培技术，从一个外植体一年便可繁殖出400万株兰花：石刁柏(Asparagus)是成功地 进行组培的另一个实例，从一个茎尖无性培养，一年内可以获得30万株能移栽的植株，比传 统的繁殖方式大大提高了繁殖系数。优良自交不亲和系、雄性不育系也可进行快速无性繁殖， 其它无性繁殖作物如马铃薯、芋、大蒜的脱毒苗己在生产上广泛应用。 另外可以利用茎尖培养进行保存种质资源，特别是对那些不能产生种子的无性繁殖作物 种质资源进行保存，占用空间极少，而且便于运输和交换。 (三)胚胎培养和试管授精 1、胚胎培养 胚胎培养技术相对比较简单，在无菌条件下进行胚的剥离，再将其转移到适当的培养基 上进行培养。对于幼胚的剥离，有时需要在解剖显微镜下进行。一般地，非常幼嫩的胚对于 生长和操作是相当困难的。胚胎培养是克服远缘杂交杂种不育性的有效方法，当然剥胚时应 尽量使幼胚越大越好。胚胎培养亦可用以克服种子的休眠和那些天然种子不育而传统地进行 无性繁殖的作物，例如芋(Colocasia antiquorum)和野芋等，通过胚培有可能使其产生有性 苗。 2、试管受精 在远缘杂交和自交不亲和性植物自交中，常因遗传上的不亲和或花粉柱头不协调，造成 不能自然授粉、受精，克服这种障碍的办法之一，便是进行试管内授粉受精。试管内授粉受 精还可以诱导孤雌生殖，是获得单倍体的途径之一。 试管受精的第一种方法是培养未授粉的雌蕾群(gynoecia)(即指整个雌性生殖系统，包 括柱头、花柱和子房)于试管中，然后把花粉授在柱头上：另一方法是培养整个雌蕾群于琼 脂培养基上，用解剖刀使胎座及胚珠裸露，然后直接将花粉授在上面，此法又称为子房内授 粉(introvarian pollination)或胎座授粉(placental pollination)。还有一种方法是先进行胚珠 培养(ovule culture),然后直接授粉于胚珠上，继续进行培养直至种子成熟
7 第二阶段：营养繁殖体（propagule）的增殖。本阶段主要通过诱导腋芽和顶芽的发生、 或诱导产生不定新梢或诱导体细胞胚胎发生来产生最大量的繁殖体单位。 第三阶段：生根。将第二阶段获得的繁殖体接种在生根培养基上促使其生根。可通过在 培养基中增加一些促进生根的激素类物质，或将新梢接种在基本培养基上或者扦插在人工介 质自然生根，同时进行驯化。 第四阶段：植株定植入土。本阶段主要是保证最大的存活率，以便再生植株投入利用。 在定植入土的开始阶段，必须尽量注意保湿以提高成活率。 （二）茎尖及分生组织培养 茎尖培养（shoot tip culture）与分生组织培养（meristem culture）都需要无菌操作，切取 带有生长点的茎尖进行培养。两种类型的差别，主要在于接种外植体的大小，分生组织培养 的外植体一般仅限于分生组织或带有 1~2 个叶原基的分生组织，常小于 0.5mm，而茎尖培养 的外植体则往往在 0.5~5mm，还有切取 1~3cm 长的茎尖进行培养的。外植体愈大愈易切取， 存活率也更高一些，但太大难以进行脱毒。 茎尖培养和分生组织培养是两种重要的组织培养技术，广泛应用于一些具有较高经济价 值、且繁殖较为困难的园艺植物的快速无性繁殖，如兰花（Cymbium）的快速繁殖，据估计， 利用组培技术，从一个外植体一年便可繁殖出 400 万株兰花；石刁柏（Asparagus）是成功地 进行组培的另一个实例，从一个茎尖无性培养，一年内可以获得 30 万株能移栽的植株，比传 统的繁殖方式大大提高了繁殖系数。优良自交不亲和系、雄性不育系也可进行快速无性繁殖， 其它无性繁殖作物如马铃薯、芋、大蒜的脱毒苗已在生产上广泛应用。 另外可以利用茎尖培养进行保存种质资源，特别是对那些不能产生种子的无性繁殖作物 种质资源进行保存，占用空间极少，而且便于运输和交换。 （三）胚胎培养和试管授精 1、胚胎培养 胚胎培养技术相对比较简单，在无菌条件下进行胚的剥离，再将其转移到适当的培养基 上进行培养。对于幼胚的剥离，有时需要在解剖显微镜下进行。一般地，非常幼嫩的胚对于 生长和操作是相当困难的。胚胎培养是克服远缘杂交杂种不育性的有效方法，当然剥胚时应 尽量使幼胚越大越好。胚胎培养亦可用以克服种子的休眠和那些天然种子不育而传统地进行 无性繁殖的作物，例如芋（Colocasia antiquorum）和野芋等，通过胚培有可能使其产生有性 苗。 2、试管受精 在远缘杂交和自交不亲和性植物自交中，常因遗传上的不亲和或花粉-柱头不协调，造成 不能自然授粉、受精，克服这种障碍的办法之一，便是进行试管内授粉受精。试管内授粉受 精还可以诱导孤雌生殖，是获得单倍体的途径之一。 试管受精的第一种方法是培养未授粉的雌蕾群（gynoecia）（即指整个雌性生殖系统，包 括柱头、花柱和子房）于试管中，然后把花粉授在柱头上；另一方法是培养整个雌蕾群于琼 脂培养基上，用解剖刀使胎座及胚珠裸露，然后直接将花粉授在上面，此法又称为子房内授 粉（introvarian pollination）或胎座授粉（placental pollination）。还有一种方法是先进行胚珠 培养（ovule culture），然后直接授粉于胚珠上，继续进行培养直至种子成熟
(四)花药和花粉培养与单倍体育种 具有配子染色体数目的植物叫做单倍体植物(haploid)。值得一提的是，对于正常的二倍 体植物而言，其单倍体就只含有一个染色体组。如果原始亲本是一个多倍体，那么由此而形 成的单倍体就不只含有一个染色体组，而是孢子体染色体数的一半。目前获得单倍体的途径 主要有花药与花粉培养。 单倍体在育种上的重要性主要表现在以下几个方面。首先，可以加速优良材料的纯合。 从单倍体的染色体加倍可以获得纯合的二倍体，可以省去多代自交，快速地获得自交系，从 而缩短育种周期，减少选择群体，提高选择效率：通过单倍体的染色体加倍，也可克服优良 杂种性状的进一步分离：对于自交不亲和的异花授粉植物以及雌雄异株植物（如芦笋）都能 很快达到完全的纯合。对于不育的远缘杂种，可通过加倍获得可育双二倍体植株。由于单倍 体不存在显隐性问题，因此可利用单倍体进行诱变育种，产生的隐性突变在第一代即可表现 出来，有利于突变性状的鉴定和选择。另外，通过加倍获得的双二倍体(Dihaploid,DH)也 是构建作物分子标记遗传连锁图谱的重要材料。 1、花药与花粉培养技术 1)花药培养花药离体培养的技术比较简单。将含有适宜发育时期小孢子（常单核）的 花蕾切下，表面消毒后再用无菌蒸溜水冲洗两次，除去萼片和花瓣，立即将花药接种到适合 的培养基上进行培养。注意在剥离花药时尽量不要损伤花药，不然接种后很容易从受伤部位 产生愈伤组织，而不是从小孢子产生愈伤组织。培养温度一般在25℃左右，在光照或黑暗条 件下均可进行培养，只有当形成幼小植株后光照才显得重要，以保证叶绿素的产生和植株正 常生长。花药一般经过20~30天培养后，即可发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体 (embryoid)。将愈伤组织转移至分化培养基（再生培养基），便可进一步分化再生出植株来。 目前甜椒、茄子、大白菜、油菜、萝卜、马铃薯、番茄等作物均成功获得单倍体植株。 在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的植株不一定都是单倍体，常有倍性的变异， 要通过染色体或其它分子生物学鉴定。 2)花粉培养主要有机械分离培养法与散落花粉(shed pollen)培养法，前者通过机械 挤压花药分离出花粉，而后者是通过花药开裂而释放出大量花粉。花粉培养成功的关键是改 变小孢子的正常发育途径，最终使其形成完整植株：同时要配制适当的培养基，使预先处理 过的小孢子能在上面生长。 2、影响花药及花粉培养成功的因素 要高频率获得单倍体植株，主要有以下一些影响因素。首先是供体植株(donor plant) 的基因型。花粉形成单倍体植株（孢子体）的能力，显然受供体植株间基因型不同的影响， 因为产生花粉植株的频率随属、种、亚种和品种而有不同。如在芸墓属中，胚状体形成的难 易顺序分别是，油菜类(Brassican apus)最容易，白菜类(Brassica campestris)次之，甘蓝 类(Brassica oleracea)更难。在同种类中，又存在品种间的较大差异。王玉英等(1978)在 甜椒花药培养中发现供试的19个品种中，只有16个获得了胚状体，但多数品种的诱导频率 都不高，只有少数品种形成胚状体的频率高一些。其次是生理状态和栽培环境条件。从生长 健壮、比较幼龄的植株上选取花药要好一些。还有一个关键影响因素是小孢子发育阶段。多 数植物单核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。几种蔬菜小孢子培养适宜
8 （四）花药和花粉培养与单倍体育种 具有配子染色体数目的植物叫做单倍体植物（haploid）。值得一提的是，对于正常的二倍 体植物而言，其单倍体就只含有一个染色体组。如果原始亲本是一个多倍体，那么由此而形 成的单倍体就不只含有一个染色体组，而是孢子体染色体数的一半。目前获得单倍体的途径 主要有花药与花粉培养。 单倍体在育种上的重要性主要表现在以下几个方面。首先，可以加速优良材料的纯合。 从单倍体的染色体加倍可以获得纯合的二倍体，可以省去多代自交，快速地获得自交系，从 而缩短育种周期，减少选择群体，提高选择效率；通过单倍体的染色体加倍，也可克服优良 杂种性状的进一步分离；对于自交不亲和的异花授粉植物以及雌雄异株植物（如芦笋）都能 很快达到完全的纯合。对于不育的远缘杂种，可通过加倍获得可育双二倍体植株。由于单倍 体不存在显隐性问题，因此可利用单倍体进行诱变育种，产生的隐性突变在第一代即可表现 出来，有利于突变性状的鉴定和选择。另外，通过加倍获得的双二倍体（Dihaploid, DH）也 是构建作物分子标记遗传连锁图谱的重要材料。 1、花药与花粉培养技术 1）花药培养 花药离体培养的技术比较简单。将含有适宜发育时期小孢子（常单核）的 花蕾切下，表面消毒后再用无菌蒸溜水冲洗两次，除去萼片和花瓣，立即将花药接种到适合 的培养基上进行培养。注意在剥离花药时尽量不要损伤花药，不然接种后很容易从受伤部位 产生愈伤组织，而不是从小孢子产生愈伤组织。培养温度一般在 25℃左右，在光照或黑暗条 件下均可进行培养，只有当形成幼小植株后光照才显得重要，以保证叶绿素的产生和植株正 常生长。花药一般经过 20~30 天培养后，即可发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体 （embryoid）。将愈伤组织转移至分化培养基（再生培养基），便可进一步分化再生出植株来。 目前甜椒、茄子、大白菜、油菜、萝卜、马铃薯、番茄等作物均成功获得单倍体植株。 在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的植株不一定都是单倍体，常有倍性的变异， 要通过染色体或其它分子生物学鉴定。 2）花粉培养 主要有机械分离培养法与散落花粉（shed pollen）培养法，前者通过机械 挤压花药分离出花粉，而后者是通过花药开裂而释放出大量花粉。花粉培养成功的关键是改 变小孢子的正常发育途径，最终使其形成完整植株；同时要配制适当的培养基，使预先处理 过的小孢子能在上面生长。 2、影响花药及花粉培养成功的因素 要高频率获得单倍体植株，主要有以下一些影响因素。首先是供体植株（donor plant） 的基因型。花粉形成单倍体植株（孢子体）的能力，显然受供体植株间基因型不同的影响， 因为产生花粉植株的频率随属、种、亚种和品种而有不同。如在芸薹属中，胚状体形成的难 易顺序分别是，油菜类（Brassican apus）最容易，白菜类（Brassica campestris）次之，甘蓝 类（Brassica oleracea）更难。在同种类中，又存在品种间的较大差异。王玉英等（1978）在 甜椒花药培养中发现供试的 19 个品种中，只有 16 个获得了胚状体，但多数品种的诱导频率 都不高，只有少数品种形成胚状体的频率高一些。其次是生理状态和栽培环境条件。从生长 健壮、比较幼龄的植株上选取花药要好一些。还有一个关键影响因素是小孢子发育阶段。多 数植物单核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。几种蔬菜小孢子培养适宜
的发育阶段和培养基及其附加成分见表9-1。 表9-1几种蔬菜小孢子培养适宜的发育阶段及培养条件 附加成分 植物 花粉时期 基本培养基 花粉直接成苗诱导花粉愈伤组织 愈伤组织分化出苗 辣椒 单核 MS大量， NAA0.21.0,2,4D2.0, NAA0.2-1.0, Nitsch微量及KT0.5~1.0 KT1.0 KT0.51.0 有机 茄子 单中 MS无机， NAA0.005 2,4-D0.25-0.5, NAA0.01-0.1, H有机 KT1.0 KT1.0 KT1.02.0 甘蓝 单核-成熟Nitsch VB10.25.VB60.25. NAA0.5.KT 1.0 VB31.25,Gy7.5 番茄 减数分裂DBMⅡ NAA2.0 NAA0.1, 中期1-单核 KT1.0 KT2.0 另外，花药、花粉培养前和培养初期的预处理也是影响成功的因素。离体花蕾冷处理是 增加花药内花粉发育成为胚状体的有效方法。在十字花科等作物的培养过程中，培养初期的 短期高温(30~40℃)处理能够显著促进花粉胚状体的形成。有时还涉及到培养基与培养条 件的影响，培养条件中最重要的是温度。培养室的温度一般保持在25℃左右，对于特殊的材 料所要求的温度也有例外。试验结果表明，曼陀罗、小麦和油菜等植物都要求较高的温度， 在30-32℃下花粉愈伤组织诱导率较在26~28℃下高。花药培养对光照的要求因作物而异。 但对于花粉培养，特别是培养的早期，黑暗条件或弱光可能更有利于花粉的启动。 3、单倍体植株染色体的加倍 通过花药或花粉培养获得单倍体植株是遗传育种工作的重要材料。单倍体是不育的，因 此在单倍体育种过程中，在确认获得单倍体后，应进行染色体加倍，形成纯合的二倍体可育 植株。 尽管在诱导单倍体花粉植株的过程中，会有很少的植株自然加倍，但这种加倍的频率很 低。因此，常用的方法是利用秋水仙碱处理，如用0.02~0.5%的秋水仙碱溶液处理所获得的 单倍体植株，一般来说木本植物所用浓度要大些，时间也相对较长为宜。此外，利用单倍体 花粉植株茎段和其它部分培养，使之产生愈伤组织，己知在愈伤组织培养中会出现较高的核 内有丝分裂，从而导致染色体数目的加倍，然后在分化培养基上进一步分化芽和根，也可获 得二倍体植株。当然，对于染色体的加倍，事先和事后都要进行细胞学检查。 三、原生质体培养与体细胞杂交 1、原生质体培养与体细胞杂交技术 由于原生质体比完整的细胞更容易摄取外来的遗传物质，可以作为高等植物的遗传转化 的受体系统，而且在一定的条件下可以诱导其融合形成体细胞杂种(somatic hybrid)植株， 因而深受人们关注。目前己从多种园艺作物成功获得原生质体再生植株。 体细胞杂交就是将不同种、属或科间的两个体细胞原生质体进行融合，与常规有性杂交
9 的发育阶段和培养基及其附加成分见表 9-1。 表 9-1 几种蔬菜小孢子培养适宜的发育阶段及培养条件 植物 花粉时期 基本培养基 附加成分 花粉直接成苗 诱导花粉愈伤组织 愈伤组织分化出苗 辣椒 单核 MS 大量， Nitsch 微量及 有机 NAA 0.2~1.0, KT 0.5~1.0 2,4~D 2.0, KT 1.0 NAA 0.2~1.0, KT 0.5~1.0 茄子 单中 MS 无机， H 有机 NAA 0.005, KT 1.0 2,4-D 0.25~0.5, KT 1.0 NAA 0.01~0.1, KT 1.0~2.0 甘蓝 单核-成熟 Nitsch —— VB1 0.25, VB6 0.25, VB3 1.25, Gly 7.5 NAA 0.5, KT 1.0 番茄 减数分裂 中期 I-单核 DBM II —— NAA 2.0 KT 1.0 NAA 0.1, KT 2.0 另外，花药、花粉培养前和培养初期的预处理也是影响成功的因素。离体花蕾冷处理是 增加花药内花粉发育成为胚状体的有效方法。在十字花科等作物的培养过程中，培养初期的 短期高温（30~40℃）处理能够显著促进花粉胚状体的形成。有时还涉及到培养基与培养条 件的影响，培养条件中最重要的是温度。培养室的温度一般保持在 25℃左右，对于特殊的材 料所要求的温度也有例外。试验结果表明，曼陀罗、小麦和油菜等植物都要求较高的温度， 在 30~32℃下花粉愈伤组织诱导率较在 26~28℃下高。花药培养对光照的要求因作物而异。 但对于花粉培养，特别是培养的早期，黑暗条件或弱光可能更有利于花粉的启动。 3、单倍体植株染色体的加倍 通过花药或花粉培养获得单倍体植株是遗传育种工作的重要材料。单倍体是不育的，因 此在单倍体育种过程中，在确认获得单倍体后，应进行染色体加倍，形成纯合的二倍体可育 植株。 尽管在诱导单倍体花粉植株的过程中，会有很少的植株自然加倍，但这种加倍的频率很 低。因此，常用的方法是利用秋水仙碱处理，如用 0.02~0.5％的秋水仙碱溶液处理所获得的 单倍体植株，一般来说木本植物所用浓度要大些，时间也相对较长为宜。此外，利用单倍体 花粉植株茎段和其它部分培养，使之产生愈伤组织，已知在愈伤组织培养中会出现较高的核 内有丝分裂，从而导致染色体数目的加倍，然后在分化培养基上进一步分化芽和根，也可获 得二倍体植株。当然，对于染色体的加倍，事先和事后都要进行细胞学检查。 三、原生质体培养与体细胞杂交 1、原生质体培养与体细胞杂交技术 由于原生质体比完整的细胞更容易摄取外来的遗传物质，可以作为高等植物的遗传转化 的受体系统，而且在一定的条件下可以诱导其融合形成体细胞杂种（somatic hybrid）植株， 因而深受人们关注。目前已从多种园艺作物成功获得原生质体再生植株。 体细胞杂交就是将不同种、属或科间的两个体细胞原生质体进行融合，与常规有性杂交
不同的是打破了种间基因交流的界限，体细胞杂交过程中没有减数分裂，由两个二倍体体细 胞原生质体融合，便产生异源四倍体的杂种植株。而用同样的亲本进行有性杂交则只产生二 倍体杂种。通常在有性杂交中，父本几乎不提供细胞质，通常都出现母本细胞质遗传现象： 而在体细胞原生质体融合时，两个亲本所提供的细胞质差不多是相等的。 当然也可以利用去核原生质体(enucleated protoplast)与正常的原生质体融合而获得胞 质杂种(cybrid),这种杂种具有两个不同物种的混合胞质，但核基因则只是来自一个物种： 另外体细胞杂交也可避免有性杂交中因减数分裂所带来的性状分离。在马铃薯育种中，选择 两个优良的双单倍体进行体细胞杂交，即可获得优良的四倍体马铃薯品种。 体细胞杂交可分为以下几个步骤： 1)原生质体的分离植物细胞具有细胞壁，因此要进行体细胞杂交首先需要设法去掉细 胞壁，获得大量有活力的原生质体。材料的来源一般采用叶肉、茎尖或液体悬浮培养的细胞， 在有合适的渗透稳定剂溶液中（如在高渗的蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇溶液），运用分离细胞 和降解细胞壁的酶（如果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）混合处理，进行原生质体分离。 2)诱导原生质体的融合原生质体的融合是体细胞杂交的关键.有自发融合(spontaneous fusion)和诱导融合(induced fusion)两类。当酶降解细胞壁时，常常可以发现相邻的同源原 生质体融合在一起形成同核体(homokaryons),即自发融合。这种自发融合的每一个同核体 中可以发现有2~40个核。当利用正处于活跃分裂的培养细胞制备原生质体时，更容易出现 这种多核融合体。 诱导融合分为化学融合和电融合两种。化学融合多采用高分子量的(1500-6000MW) 28~50%的聚乙二醇(PEG)处理，两个不同物种的异源原生质体就会形成粘连的团聚体，然 后再用高钙(Ca2+)、高pH的溶液处理，诱导融合率可提高到30-50%或更高一些，形成异 核体(heterokaryons)。电融合也是较流行的融合方法，主要步骤是：原生质体悬浮液在两极 间施加高频交流电场（一般为0.4~1.5MHz,100250V/cm),使原生质体偶极化而沿电场线 方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链：再用一次或多次瞬间高压直流电脉 冲（一般为3×10μs,1~3KV/cm)来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。 3)异核体的识别和杂种细胞的选择识别真正的异核体识别采用的方法主要有：根据原 生质体特性差异的机械选择法。有人采用形态上有明显差别的原生质体作为融合材料，如胡 萝卜与大麦进行体细胞杂交，利用胡萝卜具有稠密细胞质，无色质粒和淀粉粒的细胞，大麦 则采用具有叶绿体的叶肉细胞，两者的原生质体融合，就能从融合体中找到具有两者特征的 异核体，异核体经重建细胞壁和核融合后，便成为杂种细胞。或者根据杂种细胞生长差异的 选择方法，即利用选择性培养基供杂种细胞选择生长。第三种方法是突变细胞互补选择法。 如利用光敏感性，叶绿素缺陷突变体供互补选择：利用生化突变供杂种细胞的互补选择以及 利用两个非等位白化突变来选择杂种细胞（杂种细胞经互补转为绿色）等。 4)杂种植株的再生获得杂种细胞后在适当的培养基上促进杂种细胞持续分裂，逐渐形 成肉眼可见的愈伤组织，然后再将其转移至分化培养基上进行培养，诱导其分化出胚状体、 芽和根等，形成完整植株。 2、原生质体培养与体细胞杂交的应用 原生质体培养可直接用于作物改良。如从马铃薯叶肉原生质体细胞克隆再生植株群中表 10
10 不同的是打破了种间基因交流的界限，体细胞杂交过程中没有减数分裂，由两个二倍体体细 胞原生质体融合，便产生异源四倍体的杂种植株。而用同样的亲本进行有性杂交则只产生二 倍体杂种。通常在有性杂交中，父本几乎不提供细胞质，通常都出现母本细胞质遗传现象； 而在体细胞原生质体融合时，两个亲本所提供的细胞质差不多是相等的。 当然也可以利用去核原生质体（enucleated protoplast）与正常的原生质体融合而获得胞 质杂种（cybrid），这种杂种具有两个不同物种的混合胞质，但核基因则只是来自一个物种； 另外体细胞杂交也可避免有性杂交中因减数分裂所带来的性状分离。在马铃薯育种中，选择 两个优良的双单倍体进行体细胞杂交，即可获得优良的四倍体马铃薯品种。 体细胞杂交可分为以下几个步骤： 1）原生质体的分离 植物细胞具有细胞壁，因此要进行体细胞杂交首先需要设法去掉细 胞壁，获得大量有活力的原生质体。材料的来源一般采用叶肉、茎尖或液体悬浮培养的细胞， 在有合适的渗透稳定剂溶液中（如在高渗的蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇溶液），运用分离细胞 和降解细胞壁的酶（如果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）混合处理，进行原生质体分离。 2）诱导原生质体的融合 原生质体的融合是体细胞杂交的关键。有自发融合（spontaneous fusion）和诱导融合（induced fusion）两类。当酶降解细胞壁时，常常可以发现相邻的同源原 生质体融合在一起形成同核体（homokaryons），即自发融合。这种自发融合的每一个同核体 中可以发现有 2~40 个核。当利用正处于活跃分裂的培养细胞制备原生质体时，更容易出现 这种多核融合体。 诱导融合分为化学融合和电融合两种。化学融合多采用高分子量的（1500~6000MW） 28~50％的聚乙二醇（PEG）处理，两个不同物种的异源原生质体就会形成粘连的团聚体，然 后再用高钙（Ca2+）、高 pH 的溶液处理，诱导融合率可提高到 30~50％或更高一些，形成异 核体（heterokaryons）。电融合也是较流行的融合方法，主要步骤是：原生质体悬浮液在两极 间施加高频交流电场（一般为 0.4~1.5MHz，100~250V/cm），使原生质体偶极化而沿电场线 方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链；再用一次或多次瞬间高压直流电脉 冲（一般为 3×10μs，1~3KV/cm）来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。 3）异核体的识别和杂种细胞的选择识别 真正的异核体识别采用的方法主要有：根据原 生质体特性差异的机械选择法。有人采用形态上有明显差别的原生质体作为融合材料，如胡 萝卜与大麦进行体细胞杂交，利用胡萝卜具有稠密细胞质，无色质粒和淀粉粒的细胞，大麦 则采用具有叶绿体的叶肉细胞，两者的原生质体融合，就能从融合体中找到具有两者特征的 异核体，异核体经重建细胞壁和核融合后，便成为杂种细胞。或者根据杂种细胞生长差异的 选择方法，即利用选择性培养基供杂种细胞选择生长。第三种方法是突变细胞互补选择法。 如利用光敏感性，叶绿素缺陷突变体供互补选择；利用生化突变供杂种细胞的互补选择以及 利用两个非等位白化突变来选择杂种细胞（杂种细胞经互补转为绿色）等。 4）杂种植株的再生 获得杂种细胞后在适当的培养基上促进杂种细胞持续分裂，逐渐形 成肉眼可见的愈伤组织，然后再将其转移至分化培养基上进行培养，诱导其分化出胚状体、 芽和根等，形成完整植株。 2、原生质体培养与体细胞杂交的应用 原生质体培养可直接用于作物改良。如从马铃薯叶肉原生质体细胞克隆再生植株群中表