性，形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域， ·甲基化干扰实验：根据DM5(硫酸二甲酯)能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够 特异切割甲基化的G残基这一原理，这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基 化对于此后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNM与蛋白质之间 相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化，但仍不愧为足 迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 第三章基因工程的工具酶 重点：限制性内切酶、DNA连接和DNA聚合酶的生化待征、作用原理和应用领域。包括 Ⅱ型限制性内切酶，T4DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，大肠杆菌DNA聚合酶I,Klenow 酶，T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，反转录酶，Taq DNA聚合酶，PfuDNA聚合酶和反转 录酶。T4多核甘酸激酶、碱性磷酸酶和末端转移酶的作用原理和应用领域。 难点：切口转移与核苷酸标记技术 (一)限制性内切跨和甲基化酶 ·在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。两个单链断裂部 位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的DNA片断， 也往往具有互补的单链延伸末端。 (二)DNA连接酶 ·能够将DNA链上彼此相的3羟基(OH)和5'磷酸基团(-P),在NAD+或ATP供 能的作用下，形成磷酸二酯键。 ■只能连接切口(nick),不能连接缺口(p而且被连接的DNA链必需是双螺旋 DNA分子的一部分. 6
6 性，形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定 DNA 片段之间的结合区域。 ▪ 甲基化干扰实验：根据 DMS（硫酸二甲酯）能够使 G 残基甲基化，而六氢吡啶又能够 特异切割甲基化的 G 残基这一原理。这种技术可以检测靶 DNA 中特异 G 残基的优先甲基 化对于此后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示 DNA 与蛋白质之间 相互作用的模式。DMS 化学干扰的主要局限性时，它只能使 G 残基甲基化，但仍不愧为足 迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中 DNA 与蛋白质相互作用的精确位置。 第三章 基因工程的工具酶 重点：限制性内切酶、DNA 连接酶和 DNA 聚合酶的生化特征、作用原理和应用领域。包括 Ⅱ型限制性内切酶，T4 DNA 连接酶，大肠杆菌 DNA 连接酶，大肠杆菌 DNA 聚合酶 I，Klenow 酶，T4 DNA 聚合酶，T7 DNA 聚合酶，反转录酶，Taq DNA 聚合酶，Pfu DNA 聚合酶和反转 录酶。T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶和末端转移酶的作用原理和应用领域。 难点：切口转移与核苷酸标记技术 （一）限制性内切酶和甲基化酶 ◼ 在 DNA 双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子，产生链的断裂。两个单链断裂部 位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的 DNA 片断， 也往往具有互补的单链延伸末端。 （二）DNA 连接酶 ◼ 能够将 DNA 链上彼此相邻的 3’-羟基（OH）和 5’-磷酸基团（-P），在 NAD+或 ATP 供 能的作用下，形成磷酸二酯键。 ◼ 只能连接切口（nick），不能连接缺口（gap）。而且被连接的 DNA 链必需是双螺旋 DNA 分子的一部分
(三)DNA聚合酶 1.E.coli Pol1的特点 (1)具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的 片段，其中小片段具5'一3'外切酶活性，大片段具3'一5'外切酶活性和聚合酶活性（大片段 亦称为Klenow片段， (2)聚合酶活性 5'一3，要求3-OH引物和模板DNA,其延续性受反应条件的影响 2、Klenow片段 由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的大片段分子.仍具有 5'→3的紧合酶活性和3→5'的外切酶活性，失去了全酶的5'→3'外切酶活性。 3、T4DNA聚合酶 从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶，具有5'一3'的 聚合酶活性和3一5'外切酶活性。5'一3聚合酶活性，1500nt/min,为Pol1的两倍 3→5外切酶活性，可作用于sDNA和ds DNA,其切除速度分别为40和400Ont/min 4、反转录聘 ■许多RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反 转录酶(AMN) ■AMN具有a链和B链；a链具有聚合酶活性和RNase H活性；B链具有以RNA-DNA 杂交分子为底物的5'→3'脱氧核酸外切酶活性 5.T7DNA聚合酶 。1978年5.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌奇主细胞中纯化出来的一种聚合酶。 ■加工形式的T7DNA聚合酶系：T7噬菌体编码的基铟5蛋白质，另一种是大肠杆菌
7 （三）DNA 聚合酶 1、E.coli Pol I 的特点 （1）具两种外切酶活性和 DNA 聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的 片段，其中小片段具 5’→3’外切酶活性，大片段具 3’→5’外切酶活性和聚合酶活性（大片段 亦称为 Klenow 片段）。 （2）聚合酶活性 5’→3’, 要求 3’-OH 引物和模板 DNA，其延续性受反应条件的影响 2、Klenow 片段 由大肠杆菌 DNA 聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的大片段分子。仍具有 5’→3’的聚合酶活性和 3’→5’ 的外切酶活性，失去了全酶的 5’→3’外切酶活性。 3、T4DNA 聚合酶 从 T4 噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的 DNA 聚合酶，具有 5’→3’的 聚合酶活性和 3’→5’外切酶活性。5’→3’聚合酶活性，1500 nt/min, 为 Pol I 的两倍 3’→5’外切酶活性，可作用于 ss DNA 和 ds DNA，其切除速度分别为 40 和 4000nt/min 4、反转录酶 ◼ 许多 RNA 肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反 转录酶（AMV） ◼ AMV 具有 α 链和 β 链；α 链具有聚合酶活性和 RNase H 活性；β 链具有以 RNA-DNA 杂交分子为底物的 5’→3’脱氧核酸外切酶活性 5、T7DNA 聚合酶 ◼ 1978 年，S. Tabor 从感染了 T7 噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种聚合酶。 ◼ 加工形式的 T7 DNA 聚合酶系：T7 噬菌体编码的基因 5 蛋白质，另一种是大肠杆菌