生物大分子波谐学原理 吴季辉 第六章 同核核磁实验方法 COSY型实验 多量子谱 TOCSY NOESY ROESY
第六章 同核核磁实验方法 COSY型实验 多量子谱 TOCSY NOESY ROESY 生物大分子波谱学原理 吴季辉
生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核核磁谱 通常所谓同核核磁谱指的是H同核谱，因为一般有机物富 含氢，而H的天然丰度达99.98%，而且H的旋磁比最大，因而 核磁信号最强。其他核的核磁信号的检测相对来讲都比较困难， 尤其是蛋白质中有意义的如13C,15N的天然丰度分别只有1.11% 和0.36%，相对H的检测灵敏度(S)只有0.0159和0.00104，因此要 检测蛋白质中的13C及15N一般要有同位素标记才行，而且还需长 时间累加。cnye(yaB/2 一 般同核谱可研究的蛋白质分子量的上限在1万左右，当然还要 求蛋白质在溶液中有足够的溶解度，化学位移的分布比较分散。 蛋白质中质子的化学位移基本上是random coil的化学位移加上不 同构象的影响。如B折叠多的蛋白质同α螺旋多的蛋白质相比， 化学位移更为分散，谱峰也更容易解析；同种氨基酸残基多的 蛋白质，即使分子量较小，由于化学位移可能会比较密集，谱 峰解析可能比稍大一些的蛋白质还要困难
同核核磁谱 生物大分子波谱学原理 吴季辉
生物大分子波谐学原理 吴季辉 同核核磁谱 在记录二维谱或三维谱等之前均需要记录一维氢谱，通常蛋 白质溶于水或适当的缓冲液，加5-10%的D,O作为锁场介质。 维氢谱可用于检查样品是否有足够浓度，通常16一32次采样要 能得到足够信噪比的谱图，甲基由于快速旋转呈现窄峰，而酰 胺质子由于化学交换及14N的标量弛豫呈现宽峰； 维氢谱还可用于检查样品的共振峰宽是否合理，蛋白质在 高浓度下容易聚集从而增宽谱线，严重时甚至H谱上看不到明 显的峰，样品在这种条件下显然无法进行核磁研究；一维氢谱 还可用于判别样品的化学位移分布情况，可判别样品是否变性， 同时也对研究工作的难度提供一些预测。 蛋白质的一维氢谱一般不应该有非常尖的峰，若出现这种峰 往往是残留的小分子杂质，当然蛋白质的末端及1oop区由于分子 运动较快也会出现一些较尖的峰
同核核磁谱 在记录二维谱或三维谱等之前均需要记录一维氢谱，通常蛋 白质溶于水或适当的缓冲液，加5-10%的D2O作为锁场介质。一 维氢谱可用于检查样品是否有足够浓度，通常16－32次采样要 能得到足够信噪比的谱图，甲基由于快速旋转呈现窄峰，而酰 胺质子由于化学交换及14N的标量弛豫呈现宽峰； 一维氢谱还可用于检查样品的共振峰宽是否合理，蛋白质在 高浓度下容易聚集从而增宽谱线，严重时甚至1H谱上看不到明 显的峰，样品在这种条件下显然无法进行核磁研究；一维氢谱 还可用于判别样品的化学位移分布情况，可判别样品是否变性， 同时也对研究工作的难度提供一些预测。 蛋白质的一维氢谱一般不应该有非常尖的峰，若出现这种峰， 往往是残留的小分子杂质，当然蛋白质的末端及loop区由于分子 运动较快也会出现一些较尖的峰。 生物大分子波谱学原理 吴季辉
生物大分子波谱学原理 吴季辉 当样品条件不佳时，一维谱（以及若干信号强的二维谱 如H-15 N HSOC)可用来探索适合的样品条件。 15N (ppm) 110 115 120 125 130 9 6 10 7 6 1H (ppm) H"(ppm) ubiquitin(一种蛋白质，76个残 基)的一维谱：a水溶液中，b 箭头所指甲基区的放大，c8M尿 素溶液中，显示变性谱
当样品条件不佳时，一维谱（以及若干信号强的二维谱 如1H- 15N HSQC）可用来探索适合的样品条件。 生物大分子波谱学原理 吴季辉 ubiquitin（一种蛋白质，76个残 基）的一维谱：a 水溶液中，b 箭头所指甲基区的放大，c 8M尿 素溶液中，显示变性谱
生物大分子波谱学原理 吴季辉 A Strategy for Elucidating the Structure of Peptides/Proteins Using 2D Proton Homonuclear NMR Experiments Obtain primary sequence of peptide/protein Collect 2D NMR spectra H-H DQF-COSY H-IH TOCSY,short and long mixing times H-H NOESY,short and long mixing times Assign spin systems use TOCSY and DQF-COSY spectra and,if necessary,NOESY spectra Assign sequential amino acids use NOESY HN-HN and HN-Ha regions Obtain structural information from NMR spectra NOESY cross peak intensities H班 DQF-COSY 3JHN-Ha φ PE COSY 3JHa-H邱 Z H20/D20 exch. HN exchange rates h-bonds Generate structure Use software that "folds"primary sequence on basis of structural info Visualize structures using molecular graphics Refine structure,if needed,with additional data
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