茎 第四节蛋白质的理化性质 学 化 及其分高乾牝 理化性质 分离纯化 原则 方法 膜分 分析鉴定
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质电泳 在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带 负电荷，在电场中向正极移动；在等电 点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷， 在电场中向负极移动，这种现象称为蛋 白质电泳。 不同的蛋白质，等电点不同，相同pH 条件下，分子所的带电荷不同，且分子 大小也不同，故在电场中的移动速度也 不同，据此可互相分离。 分离纯化 分析鉴定 理化性质 原则 方法 利用差异 沉淀 电泳 层析 离心 膜分离 蛋白质电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利 用人工合成的凝胶作为支持介质的区带 电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰 胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过 聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。 该电泳具有浓缩效应、分离效应和分子 筛效应。 蛋白质电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠 （SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇） 使蛋白质变性。SDS通过疏水尾巴与肽 链中的氨基酸的疏水侧链结合。所有蛋 白质-SDS复合物为椭圆棒，短轴恒定， 长轴与蛋白质分子量成比例，使电泳迁 移率主要取决于蛋白质分子量。所以 SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和 大致测定蛋白质的分子量。 蛋白质电泳 等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入 两性电解质从而构成从正极到负极pH逐 渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子 在电场的作用下运动，最后各自停留在 其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦 位置的pH值，便可以得到它的等电点。 蛋白质电泳 双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳 和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)组成，第一向使等电点不 同的蛋白得到分离，第二向使分子量不 同的蛋白得到分离，两向结合便得到高 分辨率的蛋白图谱。 (1) (2) 1 ④ ⑤ ⑥ ① ② ③
生物 第四节蛋白质的理化性质 化学 及其分膏纯化 理化性质 蛋白质层析技术 分离纯化 亲和层析： 原则 利用蛋白质特异性结合进行分离。 2 方法 载体：Sepharose4等。 利用差异 空间臂：常为双功能基团，如己二氨或￡ ② 氨基己酸。 电泳 配基选择：抗原抗体，酶抑制剂 层析 偶联：溴化氰法，环氧氯丙烷法 疏水层析，HPLC 膜分离 3 分析鉴定 批义人过心小阿虫口贝
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质层析技术 层析是一种利用混合物中各组分理化 性质的差异，在相互接触的两相（固定 相与流动相）之间的分布不同而进行分 离分析的技术方法。 主要的层析技术有凝胶过滤，离子交 换层析，吸附层析及亲和层析等。 分离纯化 分析鉴定 理化性质 原则 方法 利用差异 沉淀 电泳 层析 离心 膜分离 蛋白质层析技术 凝胶过滤： 根据多孔载体对不同大小，形状的蛋 白分子的排阻能力不同，导致其在层析 柱中滞留的时间不同，分子从达到小依 次先后排出，从而将各个组分分开的一 种层析，又称凝胶过滤层析。 应用：分离蛋白质、除盐、测蛋白质分 子量 通常所用的填料为： Sephadex: (交 联葡聚糖) Bio-gel: (聚丙烯酰胺) 蛋白质层析技术 离子交换层析： 根据蛋白质的电荷与层析载体（离子交 换剂）电荷之间的相互作用强弱不同而达 到分离目的。分阳离子交换和阴离子交换 2 离子交换介质： 离子交换树脂；Sepharose (交联葡聚糖) 蛋白质层析技术 亲和层析： 利用蛋白质特异性结合进行分离。 载体：Sepharose 4等。 空间臂：常为双功能基团，如己二氨或ε－ 氨基己酸。 配基选择：抗原―抗体，酶―抑制剂 偶联：溴化氰法,环氧氯丙烷法 疏水层析，HPLC (1) (2) 1 ④ ⑤ ⑥ ① ② ③
芝物 第四节蛋白质的理化性质 及其分高充化 理化性质 蛋白质离心技术 2 分离纯化 利用蛋白质的密度的不同，经超速离心后， 原则 分布于不同的液层而分离。 2 方法 蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比，S 利用差 与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同 紧密颗粒的摩擦系数小·沉降快；而疏松颗 电泳 泣的摩擦系数大-沉降慢。 应用：蛋白质的分离纯化和测分子量。沉降 离心 速度法和沉降平衡法测蛋白质的分子量。 膜分淫 密度梯度离心。 分析鉴定
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质离心技术 利用蛋白质的密度的不同，经超速离心后， 分布于不同的液层而分离。 蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比，S 与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同， 紧密颗粒的摩擦系数小－沉降快；而疏松颗 粒的摩擦系数大－沉降慢。 应用：蛋白质的分离纯化和测分子量。沉降 速度法和沉降平衡法测蛋白质的分子量。 密度梯度离心。 分离纯化 分析鉴定 理化性质 原则 方法 利用差异 沉淀 电泳 层析 离心 膜分离 (1) (2) 1 ④ ⑤ ⑥ ① ② ③