5ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3 tatccaacggctaggcattt ataagcccgaaaggttcgtt 3'TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.···. GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5 延伸(72C,1~几分钟) ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC. CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAA TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAA ATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATT 循环25~30
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt 延伸（720C，1 ～ 几分钟） TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATT T ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAA A ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAA A TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt 循环 25 ～30 5′ 3′ 3′ 5′
2、PCR的反应动力学 PCR反应中，DNA扩增遵循酶促反应动力学原则。反应初期，目的 DNA片段的增加呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐渐积累，酶 的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定 状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需要的 PCR循环数取决于样品模板的拷贝数、PCR的扩增效率以及DNA聚合 酶种类和活性，以及非特异性产物的竞争等因素。 多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。但在平台期之前，扩 增的目的DNA片段数量已经满足实验的需要，如果产量不够，可将产 物DNA样品稀释后作为模板，进行新一轮PCR反应
2、PCR的反应动力学 PCR反应中，DNA扩增遵循酶促反应动力学原则。反应初期，目的 DNA片段的增加呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐渐积累，酶 的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定 状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需要的 PCR循环数取决于样品模板的拷贝数、PCR的扩增效率以及DNA聚合 酶种类和活性，以及非特异性产物的竞争等因素。 多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。但在平台期之前，扩 增的目的DNA片段数量已经满足实验的需要，如果产量不够，可将产 物DNA样品稀释后作为模板，进行新一轮PCR反应
三、PCR反应体系与反应条件 1、标准的PCR反应体系 (50100ul) 10×缓冲液 1/10体积 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各1umol/L 模板DNA 102~105拷贝 Taq DNA聚合酶 1~5u Mg2+ 1.5mmol/L 双蒸水 至50100ul
1、标准的PCR反应体系 （50～100ul） 三、PCR反应体系与反应条件 10×缓冲液 1/10体积 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各1u mol/L 模板DNA 1 02 ～ 1 05 拷贝 Taq DNA聚合酶 1 ～ 5u Mg2+ 1.5mmol/L 双蒸水 至50～100ul
2、PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3'引物。设计引物时 以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准)，5'端引物与位于待 扩增片段5'端上游的一小段DNA序列相同；3'端引物与位于待扩 增片段3'端的一小段D序列互补。引物设计的基本原则： ①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤 或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③引物内部不应出现互补序列： ④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3'端的互补重叠
2、PCR引物设计 ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤 或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③引物内部不应出现互补序列： ④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时 以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待 扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩 增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物设计的基本原则：