1278 生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys. 2022:49(7) (e) r 10-35A 顺中 中 交叉信号峰 HN交叉信号峰 F2/pom Fig.2 NMR thods for acquiring int parameter 图2 测定蛋白 数的NR实哈方法 NOE:b)PRE:（C)RDC。 H-NOESY-HSQC。对于分子质量较大的蛋白 b.PRE 质，则采用3D”NH. NOESY-HSOC PRE技术用于测定蛋白质结构中长程空间距 3DC-H.℃HMQC-NOESY-HMQC、3DN-H 的结构约束参数，原理如图2b所示。未成对单电 TROSY-NOESY 4D N/N HSOC-NOESY 子的顺陵性对其周围的NMR自旋原子核产生顺磁 HSQC、4DC/5 N HMOC-NOESY-HSOC和4D 效应排一步产：生原子间的偶极偶极相互作用 CC HMOC-NOESY-.HSQC。在全氘代蛋白 加快一定空间范围内(1035A)的原子核池像速 质的结构研究中，由于未能获得质子的NOE信号， 2与原子 所 ,通常将全氘代蛋白质 行 选择性质子化。例 到顺磁中心距离 酰胺基团和甲基的质子化 (3)),主要通过H,N-TROSY或H,N-HSQC等 技术进行调定如。 4.+1+i2 (3) 式中，指H原子与未配对单电子（顺磁中心》 基哌啶1氧自由基(TEMPO)等s,顺磁性离 P之间的距离(A),g是电子的g因子，u是玻尔 子螯合剂（乙二胺四乙酸(EDTA) 二乙基三题 磁子，S是总电子自旋量子数，是直空磁导率 五乙酸(DTPA)、1.47.10-四氯杂环十二烷-1.4.7 是H原子的拉摩尔频率(Hz),t,是分子相关时 10-四羧酸(D0TA)等[%1，其中MTSL标签最为 间(ns),t=(x+x),其中z是蛋白质分子的运 常用：b.融合蛋白表达法，即在蛋白质分子中通过 动相关时间 是电子弛豫时间 基因表达引入可螯合顺磁性金属离子的肽链。 通常采用以下两种方法制备顺磁性的蛋白质测 而，这些方法均在蛋白质分子链中引人了顺磁性 式试体系：.化学修饰法，常用的方法为半胱氨酸巯 物质，需要考虑它们对蛋白质自身结构的影响。 基衍生化法，即将蛋白质分子链中半胱氨酸的巯基 c RDC 与顺磁性氯氧化物自由基标签通过化学键合，得到 在较高分子质量蛋白质的结构解析中，常常存 含有顺磁性标签的衍生化蛋白质，顺磁性氯氧化物 在结构约束数据获取较少成较推获得的间颗。导致 自由基标签主要有1氧自由基-2,25,5-四甲基-D-吡 缺乏足够的约柬信息用于精确计算蛋白质的三维结 略啉-3-甲基-甲硫基磺酸盐(MTSL、2,2,6,6-四門 构，因而，需要采用RDC技术获取蛋白质分子中
·1278· 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2022；49（7） 1 H-NOESY-HSQC［84-86］ 。对于分子质量较大的蛋白 质 ， 则 采 用 3D 15N-1 H-15N HSQC-NOESY-HSQC、 3D 13C-1 H-13C HMQC-NOESY-HMQC、 3D 15N-1 H TROSY-NOESY、 4D 15N/15N HSQC-NOESYHSQC、 4D 13C/15N HMQC-NOESY-HSQC 和 4D 13C/13C HMQC-NOESY-HSQC［87-90］。在全氘代蛋白 质的结构研究中，由于未能获得质子的NOE信号， 所以，通常将全氘代蛋白质进行选择性质子化，例 如酰胺基团和甲基的质子化［91-92］ 。 b. PRE PRE技术用于测定蛋白质结构中长程空间距离 的结构约束参数，原理如图2b所示。未成对单电 子的顺磁性对其周围的NMR自旋原子核产生顺磁 效应，进一步产生原子间的偶极-偶极相互作用， 加快一定空间范围内 （10~35 Å） 的原子核弛豫速 率 （即 PRE 速率，RPara 2）［93］ 。RPara 2 与原子核 到顺磁中心距离 （rH-P） 的六次方成反比 （公式 （3）），主要通过1 H, 15N-TROSY 或1 H, 15N-HSQC 等 技术进行测定［94］ 。 RPara 2 = 1 15 ( μ0 4π ) 2 γ2 1 g2 e μ2 B S(S + 1) r 6 H - P ( 4τc + 3τc 1 + ω2 H τ2 c ) (3) 式中，rH-P指1 H 原子与未配对单电子 （顺磁中心） P之间的距离 （Å），ge是电子的g因子，μB是玻尔 磁子，S 是总电子自旋量子数，μ0是真空磁导率， ωH是1 H原子的拉摩尔频率 （Hz），τc是分子相关时 间 （ns），τc=（τ -1 r +τ -1 s）-1 ，其中 τr是蛋白质分子的运 动相关时间，τs是电子弛豫时间。 通常采用以下两种方法制备顺磁性的蛋白质测 试体系：a. 化学修饰法，常用的方法为半胱氨酸巯 基衍生化法，即将蛋白质分子链中半胱氨酸的巯基 与顺磁性氮氧化物自由基标签通过化学键合，得到 含有顺磁性标签的衍生化蛋白质，顺磁性氮氧化物 自由基标签主要有1-氧自由基-2,2,5,5-四甲基-D-吡 咯啉-3-甲基-甲硫基磺酸盐 （MTSL）、2,2,6,6-四甲 基哌啶-1-氧自由基 （TEMPO） 等［95-96］ ，顺磁性离 子螯合剂 （乙二胺四乙酸 （EDTA）、二乙基三胺 五乙酸 （DTPA）、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7, 10-四羧酸（DOTA）等［96-98］ ，其中MTSL标签最为 常用；b. 融合蛋白表达法，即在蛋白质分子中通过 基因表达引入可螯合顺磁性金属离子的肽链［99］。 然而，这些方法均在蛋白质分子链中引入了顺磁性 物质，需要考虑它们对蛋白质自身结构的影响。 c. RDC 在较高分子质量蛋白质的结构解析中，常常存 在结构约束数据获取较少或较难获得的问题，导致 缺乏足够的约束信息用于精确计算蛋白质的三维结 构，因而，需要采用RDC技术获取蛋白质分子中 Fig. 2 NMR experimental methods for acquiring protein structural constraint parameters 图2 测定蛋白质结构约束参数的NMR实验方法 （a）NOE；（b）PRE；（c）RDC
2022:49(7) 尹林，等：核磁共振波谱法在蛋白质三维结构解析中的应用 1279 化学键空间取向的约束参数，得到蛋白质中不同结 质的取向作用前的摆合常数为】.受到顺磁性介质 构域之间相对取向的约束信息[]。RDC是指原于 作用产生取向后的耦合常数则为J和残余偶极耦合 核俚极矩间的偶极偶极相石作用产生偶极偶极跳 常数(D)之和。D与原子核P和Q之间的键矢量 豫效应， 导致NMR信号裂分 (偶极拥合裂分)的 ()以及排列张量坐标轴取向 )的 系列于 现象。如图2c所示，对于蛋白质分子中存在偶： 式(4)【，根据计算软件进一步计算蛋白质二级 耦合相互作用的原子核P和Q,它们受到顺磁性介 结构域的空间取向信息。 (Ar.(ow1)e (4) 式中，D是残余偶极耦合常数()，B,是磁感应 a fret 强度(T),k是玻尔兹曼常数 T是测试温度 与PRE技术获得距离约束参数的原理类似 (K),h是普朗克常数，o为存在偶极耦合相互作 FRET法也是基于偶极-偶极相互作用原理，即如果 用的原子核P和Q之间的距离(A),和。分别是 蛋白质分子内或分子间的两个荧光生色团相距一定 发生偶极桐合相互作用原子核P和Q的旋磁比， 距离（约2080A),并且荧光供体基团的荧光发 ￥和△y,分别是磁感应张量的轴向分量和正交分 射被长与荧光受体基团的吸收波长有一定的重叠 荧光供体基团将把能量转移给荧光受体基 子在溶液中处于各向同性的快速翻 使受体基团被激发，产生红移的次级 运动状态，这种各向同性运动带来的平均效应使得 光。上述两个波长重叠的程度越大，FRE门 其偶极耦合裂分的净值为零m。所以，需要采取 能量转移的效率越高。因此，根据FRET能量转利 一些方法限制蛋白质的快速翻滚运动，促使蛋白质 效率，可计算它们之间的距离（公式(5）))。 一定的各向异性，使得偶极耦合裂分的净值不 <R=RKE- 为零。目前文献报道大致有以下两种方法 式中， R为供体和受体荧光基团之间的距离 天然蛋白质含有各向异性磁化率的顶性金属离于 (A),E为FRET能量转移效率，R,为Forster距 (如F等)，其周有磁化率可以使蛋白质产生弱 (即某一给定供体受体对的临界转移距离)。常用 向.进而产生RDC信号：b.利用外部取向介质 的荧光供体单体有丹磺酰氯、AlexaFluor类荧光分 诱导蛋白质分子在溶液中定向排列，出现的各向异 子、Tb*荧光离子和四甲基罗丹明(TMR),荧光 性可产生10倍以上的RDC信号[。常用的取向 受体单体为异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy3和Cy 介质包括顺磁 金属（如Fe和铜系金属） 荧光分子，丹磺酰-FTC AlexaFluor488-Cy5利 聚乙二醇分子液品、DNA纳米管液品、取向聚丙 Tb”Cy3在FRET能量转移效率达到50%时，R分 烯酰胺凝胶以及取向胶原蛋白凝胶等【s10]如果 别为38、52和62A11。 在蛋白质测试体系中加入两种以上定取向介质，促 在解析蛋白质三维结构方面，单分子FRET 使蛋白质分子沿不同方向定向排列则可获得多个 molecule fret smeret)根据得到的距 D值。计算出更加准确的蛋白质 三维结构 离约束参数并结合分子动力学模拟计 可用 要注意的是，由于外部取向介质法的诱导机制归功 研究运动时间尺度在毫秒范周的蛋白质构象动态变 于蛋白质与介质的空间和电荷相互作用，因此，必 化4。例如.Ha等51将荧光供体(TMR)和 须考虑取向介质对蛋白质自身的结构影响四。 和荧光受体(Cv5)分别修饰到街萄球茵核酸酶 2.42其他生物物理技术铺助解析蛋白质三维结构 (staphylococcal nuclease.SNase)的两个特定位 些生物物理技术有助 点， 通过smFRE SNase分 中TMR 例如荧光共振 Cy5基团的FRET能量转移效率和它们之间的距离 量转移法(Forster/fluorescence resonance energ 发现SNase分子之间存在蛋白骨架结构或侧链在 transfer,,FRET)、化学交联结合质谱技术 毫秒级时间范围内的波动。膜蛋白具有丰富的生命 (chemical cross-linking coupled with mass 功能，与许多疾病有关，已成为主要的药物靶点， spectrometry,CXMS)、小角X射线散射技术法 近期研究报道了采用smFRET研究膜蛋白折叠结构 (mall angel X-ray.SAXS)和冷冻电镜 动力学， 例如研究自插入螺旋膜蛋白和细菌毒素 法(Cryo-electron microscopy,Cyo-EM)。 组装和折叠动力学以及突变引起的膜蛋白错误折叠
2022；49（7） 尹林，等：核磁共振波谱法在蛋白质三维结构解析中的应用 ·1279· 化学键空间取向的约束参数，得到蛋白质中不同结 构域之间相对取向的约束信息［100］ 。RDC是指原子 核偶极矩间的偶极-偶极相互作用产生偶极-偶极驰 豫效应，导致NMR信号裂分 （偶极耦合裂分） 的 现象。如图2c所示，对于蛋白质分子中存在偶极 耦合相互作用的原子核P和Q，它们受到顺磁性介 质的取向作用前的耦合常数为J，受到顺磁性介质 作用产生取向后的耦合常数则为J和残余偶极耦合 常数 （D） 之和。D与原子核P和Q之间的键矢量 （θ） 以及排列张量坐标轴取向 （φ） 的关系列于公 式 （4）［101］ ，根据计算软件进一步计算蛋白质二级 结构域的空间取向信息。 D = - 1 4π B2 0 15kBT γP γQ h 4π2 r 3 P - Q [ ∆χax (3 cos 2 θ - 1) + 1.5∆χrh sin2 θ cos 2φ ] (4) 式中，D是残余偶极耦合常数 （Hz），B0是磁感应 强度 （T），kB 是玻尔兹曼常数，T 是测试温度 （K），h是普朗克常数，rP-Q为存在偶极耦合相互作 用的原子核P和Q之间的距离（Å），γP和γQ分别是 发生偶极耦合相互作用原子核 P 和 Q 的旋磁比， ∆χax和∆χrh分别是磁感应张量的轴向分量和正交分 量；θ和φ分别是键矢量和排列张量坐标轴的取向。 蛋白质分子在溶液中处于各向同性的快速翻滚 运动状态，这种各向同性运动带来的平均效应使得 其偶极耦合裂分的净值为零［102］ 。所以，需要采取 一些方法限制蛋白质的快速翻滚运动，促使蛋白质 产生一定的各向异性，使得偶极耦合裂分的净值不 为零。目前文献报道大致有以下两种方法：a. 一些 天然蛋白质含有各向异性磁化率的顺磁性金属离子 （如Fe3+ 等），其固有磁化率可以使蛋白质产生弱取 向，进而产生RDC信号［103］ ；b. 利用外部取向介质 诱导蛋白质分子在溶液中定向排列，出现的各向异 性可产生 10 倍以上的 RDC 信号［104］ 。常用的取向 介质包括顺磁性金属 （如Fe3+ 和镧系金属）、烷基- 聚乙二醇分子液晶、DNA纳米管液晶、取向聚丙 烯酰胺凝胶以及取向胶原蛋白凝胶等［105-110］ 。如果 在蛋白质测试体系中加入两种以上定取向介质，促 使蛋白质分子沿不同方向定向排列，则可获得多个 D值，计算出更加准确的蛋白质三维结构［111］ 。需 要注意的是，由于外部取向介质法的诱导机制归功 于蛋白质与介质的空间和电荷相互作用，因此，必 须考虑取向介质对蛋白质自身的结构影响［112］ 。 2.4.2 其他生物物理技术辅助解析蛋白质三维结构 近期研究表明，一些生物物理技术有助于 NMR解析蛋白质的三维结构［113］ ，例如荧光共振能 量 转 移 法 （Förster/fluorescence resonance energy transfer， FRET）、 化 学 交 联 结 合 质 谱 技 术 （chemical cross-linking coupled with mass spectrometry，CXMS）、小角 X 射线散射技术法 （small angel X-ray scattering，SAXS） 和冷冻电镜 法（Cryo-electron microscopy，Cryo-EM）。 a. FRET 与 PRE 技术获得距离约束参数的原理类似， FRET法也是基于偶极-偶极相互作用原理，即如果 蛋白质分子内或分子间的两个荧光生色团相距一定 距离 （约 20~80 Å），并且荧光供体基团的荧光发 射波长与荧光受体基团的吸收波长有一定的重叠， 那么，荧光供体基团将把能量转移给荧光受体基 团， 使 受 体 基 团 被 激 发，产 生 红 移 的 次 级 荧 光［113-114］。上述两个波长重叠的程度越大，FRET 能量转移的效率越高。因此，根据FRET能量转移 效率，可计算它们之间的距离（公式（5））［113］ 。 <RDA> = R0(<E-1 >-1) 1/6 （5） 式中，RDA 为供体和受体荧光基团之间的距离 （Å），E 为 FRET 能量转移效率，R0为 Förster 距离 （即某一给定供体-受体对的临界转移距离）。常用 的荧光供体单体有丹磺酰氯、AlexaFluor类荧光分 子、Tb3+ 荧光离子和四甲基罗丹明 （TMR），荧光 受体单体为异硫氰酸荧光素 （FITC）、Cy3 和 Cy5 荧光分子，丹磺酰-FITC、AlexaFluor488-Cy5 和 Tb3+ -Cy3在FRET能量转移效率达到50%时，R0分 别为38、52和62 Å［113］ 。 在解析蛋白质三维结构方面，单分子 FRET （single-molecule FRET，smFRET） 根据得到的距 离约束参数并结合分子动力学模拟计算法，可用于 研究运动时间尺度在毫秒范围的蛋白质构象动态变 化［113-114］ 。例如，Ha等［115］ 将荧光供体（TMR） 和 和荧光受体 （Cy5） 分别修饰到葡萄球菌核酸酶 （staphylococcal nuclease，SNase） 的两个特定位 点，通过 smFRET 测定单个 SNase 分子中 TMR 和 Cy5基团的FRET能量转移效率和它们之间的距离， 发现 SNase 分子之间存在蛋白骨架结构或侧链在 毫秒级时间范围内的波动。膜蛋白具有丰富的生命 功能，与许多疾病有关，已成为主要的药物靶点， 近期研究报道了采用smFRET研究膜蛋白折叠结构 动力学，例如研究自插入螺旋膜蛋白和细菌毒素的 组装和折叠动力学以及突变引起的膜蛋白错误折叠