实验一 细菌的简单染色法和革兰氏染色法 一、目的要求 1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。 2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。 3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理 1. 简单染色法： 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性 染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与 细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下 易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 2. 革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医生 Gram 创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还 可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G + 表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用 G -表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中， 当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶 紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌 的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解， 细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上 了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂 （mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain) 。碱性染料的 作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液 一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附 着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色 反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用 95％的酒精(ethanol)。复染 液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上 不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分 成 G +和 G -两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，蜡样芽孢杆菌(B. cereus)12～20h 斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤
实验一 细菌的简单染色法和革兰氏染色法 一、目的要求 1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。 2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。 3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理 1. 简单染色法： 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性 染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与 细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下 易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 2. 革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医生 Gram 创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还 可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G + 表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用 G -表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中， 当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶 紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌 的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解， 细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上 了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂 （mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain) 。碱性染料的 作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液 一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附 着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色 反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用 95％的酒精(ethanol)。复染 液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上 不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分 成 G +和 G -两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，蜡样芽孢杆菌(B. cereus)12～20h 斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤
1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少 量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 2. 干燥 室温自然干燥。 3. 固定 固定时通过火焰 2～3 次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞 质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细 胞形态。 4. 染色 （1）简单染色法： ① 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染 色 1～2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约 1min。 ② 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过 急过大，以免涂片薄膜脱落。 ③ 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 ④ 镜检 涂片干燥后镜检。 （2）革兰氏染色法： ① 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约 1～2min，水洗。 ② 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约 1min，水洗。 ③ 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用 95％酒精滴洗至流出 酒精刚刚不出现蓝色时为止，约 20～30s，立即用水冲净酒精。 ④ 复染 用番红液染 1～2min，水洗。 ⑤ 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫 色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 (3) 混合涂片法： 按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合 涂片、染色、镜检进行比较。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被 误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染 色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反 应
1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少 量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 2. 干燥 室温自然干燥。 3. 固定 固定时通过火焰 2～3 次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞 质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细 胞形态。 4. 染色 （1）简单染色法： ① 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染 色 1～2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约 1min。 ② 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过 急过大，以免涂片薄膜脱落。 ③ 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 ④ 镜检 涂片干燥后镜检。 （2）革兰氏染色法： ① 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约 1～2min，水洗。 ② 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约 1min，水洗。 ③ 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用 95％酒精滴洗至流出 酒精刚刚不出现蓝色时为止，约 20～30s，立即用水冲净酒精。 ④ 复染 用番红液染 1～2min，水洗。 ⑤ 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫 色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 (3) 混合涂片法： 按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合 涂片、染色、镜检进行比较。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被 误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染 色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反 应
实验二 细菌的芽孢和荚膜染色法 一、实验目的 1. 学习并掌握芽孢和荚膜染色法 2. 初步了解芽孢和荚膜的形态。 二、基本原理 芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的 休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢 囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染 料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、 脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性 品红（basic fuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且 也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出， 若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易 于区分。 荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易 染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托 出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。 三、器材 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），腊样芽孢杆菌（B. cereus），球形芽孢 杆菌(B. sphaericus)，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）或胶质芽孢杆菌(B. mucilaginosus)约 2d 无氮培养基琼脂斜面培养 物；孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液。 荚膜染色液：绘图墨水，1％甲基紫水溶液，1％结晶紫水溶液，6％葡萄糖 水溶液，20％硫酸铜水溶液，纯甲醇等。 四、操作步骤 （一）荚膜染色技术 方法一： （1）将培养 24h 左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。 （2）滴加 3～5 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。 （3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液 蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约 4~5min。 这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液染 10min。 （4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。 （5）用番红水溶液复染 1min，水洗。 （6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。 方法二：
实验二 细菌的芽孢和荚膜染色法 一、实验目的 1. 学习并掌握芽孢和荚膜染色法 2. 初步了解芽孢和荚膜的形态。 二、基本原理 芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的 休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢 囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染 料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、 脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性 品红（basic fuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且 也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出， 若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易 于区分。 荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易 染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托 出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。 三、器材 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），腊样芽孢杆菌（B. cereus），球形芽孢 杆菌(B. sphaericus)，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）或胶质芽孢杆菌(B. mucilaginosus)约 2d 无氮培养基琼脂斜面培养 物；孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液。 荚膜染色液：绘图墨水，1％甲基紫水溶液，1％结晶紫水溶液，6％葡萄糖 水溶液，20％硫酸铜水溶液，纯甲醇等。 四、操作步骤 （一）荚膜染色技术 方法一： （1）将培养 24h 左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。 （2）滴加 3～5 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。 （3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液 蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约 4~5min。 这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液染 10min。 （4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。 （5）用番红水溶液复染 1min，水洗。 （6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。 方法二：
（1）取两支洁净的小试管，分别加入 0.2mL 无菌水，再往一管中加入 2~3 接 种环的腊样芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入 2~3 接种环的生孢梭菌的菌苔，两管 中各自充分混合成浓厚的菌悬液。 （2）在菌悬液中分别加入 0.2mL 苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热 3~5min。 （3）用接种环分别取上述混合液 2~3 环于两载玻片上，涂薄，风干后，将载 玻片稍倾斜于烧杯上，用 95％乙醇冲洗至无红色液流出。 （4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。 （5）取 1~2 接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然风干后，油镜 观察，在淡紫色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。 （二）荚膜染色技术 1. 湿墨水法 （1）制备菌和墨水混合液 加一滴水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其 混合均匀。 （2）加盖玻片 将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤 纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。 （3）镜检 用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。 背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。 2. 干墨水法 （1）在载玻片一端滴一滴 6％葡萄糖水溶液，取少许培养了 72h 的圆褐固氮 菌在水滴中制成菌悬液，充分混匀。 （2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一 块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以 30°角接触后，顺势将菌 悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。 （3）用纯甲醇固定 1min。 （4）加番红液数滴于涂片上，冲去残余的甲醇，并染 30s，以细水流适当冲 洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。 3. Anthony 法 （1）涂片 按常规取菌涂片。 （2）固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。 （3）染色 用 1％结晶紫水溶液染色 2min。 （4）脱色 以 20％硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。 （5）镜检 干后用油镜观察 菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色
（1）取两支洁净的小试管，分别加入 0.2mL 无菌水，再往一管中加入 2~3 接 种环的腊样芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入 2~3 接种环的生孢梭菌的菌苔，两管 中各自充分混合成浓厚的菌悬液。 （2）在菌悬液中分别加入 0.2mL 苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热 3~5min。 （3）用接种环分别取上述混合液 2~3 环于两载玻片上，涂薄，风干后，将载 玻片稍倾斜于烧杯上，用 95％乙醇冲洗至无红色液流出。 （4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。 （5）取 1~2 接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然风干后，油镜 观察，在淡紫色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。 （二）荚膜染色技术 1. 湿墨水法 （1）制备菌和墨水混合液 加一滴水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其 混合均匀。 （2）加盖玻片 将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤 纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。 （3）镜检 用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。 背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。 2. 干墨水法 （1）在载玻片一端滴一滴 6％葡萄糖水溶液，取少许培养了 72h 的圆褐固氮 菌在水滴中制成菌悬液，充分混匀。 （2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一 块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以 30°角接触后，顺势将菌 悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。 （3）用纯甲醇固定 1min。 （4）加番红液数滴于涂片上，冲去残余的甲醇，并染 30s，以细水流适当冲 洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。 3. Anthony 法 （1）涂片 按常规取菌涂片。 （2）固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。 （3）染色 用 1％结晶紫水溶液染色 2min。 （4）脱色 以 20％硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。 （5）镜检 干后用油镜观察 菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色
实验三 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察 一、目的要求 1. 学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。 2. 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。 二、基本原理 鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一 项这要形态特征。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01～0.02μm，所以，除了很少数能形成鞭 毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛 均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭 毛，必须用鞭毛染色法。 鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗， 然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法，前 一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。 在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用 压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增强反差，若光线太强，细菌和周围的液体难以 区分。 三、器材 苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiengsis)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)，金黄色葡萄球菌；硝酸 银鞭毛染色液，Leifson氏染色液，0.01％美蓝水溶液；载玻片，盖玻片，凹载玻片，无菌水，凡 士林，显微镜等。 四、操作步骤 （一）鞭毛染色技术 1. 硝酸银染色法 （1）菌种的准备 要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌 种，通常要连续移种1~2次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a.取新配制的营养琼 脂斜面(表面较湿润、基部有冷凝水)接种，28~32℃培养18~30h，让菌种扩散生长，取菌落边缘 的菌苔(不要取菌落中央的菌苔)作染色观察的菌种材料。 良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色 的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。 （2）载玻片的准备 将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮约20min，取出用清水充分洗净， 沥干后置95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开） （3）菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1~2mL无菌水的试管中，制成轻度 混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。 挑菌时，尽可能不带培养基
实验三 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察 一、目的要求 1. 学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。 2. 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。 二、基本原理 鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一 项这要形态特征。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01～0.02μm，所以，除了很少数能形成鞭 毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛 均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭 毛，必须用鞭毛染色法。 鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗， 然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法，前 一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。 在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用 压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增强反差，若光线太强，细菌和周围的液体难以 区分。 三、器材 苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiengsis)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)，金黄色葡萄球菌；硝酸 银鞭毛染色液，Leifson氏染色液，0.01％美蓝水溶液；载玻片，盖玻片，凹载玻片，无菌水，凡 士林，显微镜等。 四、操作步骤 （一）鞭毛染色技术 1. 硝酸银染色法 （1）菌种的准备 要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌 种，通常要连续移种1~2次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a.取新配制的营养琼 脂斜面(表面较湿润、基部有冷凝水)接种，28~32℃培养18~30h，让菌种扩散生长，取菌落边缘 的菌苔(不要取菌落中央的菌苔)作染色观察的菌种材料。 良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色 的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。 （2）载玻片的准备 将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮约20min，取出用清水充分洗净， 沥干后置95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开） （3）菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1~2mL无菌水的试管中，制成轻度 混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。 挑菌时，尽可能不带培养基