（4）制片 取一滴菌液于载玻片上的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用 吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温（或37℃）自然干燥。 干后应尽快染色，不宜放置时间过长。 （5）染色 涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3-5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B 液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水 冲洗。若加B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。 配制合格的染色剂（尤其是B液）、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间均是 鞭毛染色成败的重要环节。 （6）镜检 干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的 一定部位观察到鞭毛。 菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。 2. 改良的Leifson氏染色法 （1）载玻片的准备、菌种材料的准备用硝酸银染色法。 （2）制片 用记号笔在载玻片反面将玻片分成3-4个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌 液。将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液。室温或37℃自然干燥。 （3）染色 加Leifson氏染色液覆盖第一区的涂面，隔数min后，加染液于第二涂面，如此 继续染第三、四区。间隔时间自行议定，其目的是为了确定最佳染色时间。在染色过程中仔细观 察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时，即直接用水轻轻冲洗（不要先倾去 染料再冲洗，否则背景不清）。染色时间大约10min。自然干燥。 （4）镜检干后用油镜观察。 菌体和鞭毛均呈红色。 （二）运动性观察 玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法。 1. 压滴法 （1）制片在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0.01％的美蓝 水溶液与其混合均匀。用镊子取一洁净的盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢 放下盖在菌液上。观察专性好氧菌时，可在放盖玻片时压入小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运 动。 （2）镜检 先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片厚 度不能超过0.17nm。观察时，要用略暗光线。 有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随 水流运动区别。 2. 悬滴法 （1）涂凡士林取洁净凹载玻片，在其四周涂少许凡士林。 （2）加菌液 在盖玻片中央滴一小滴菌液。为便于观察时寻找菌液位置，可用记号笔在菌 液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央。 （3）盖凹玻片 将凹玻片得凹槽对准盖玻片中心得菌液，并轻轻盖在盖玻片上。轻轻按压 使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液滴封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位 于凹槽中央。 若菌液加得过多，此时菌液就会流到凹玻片上面影响观察。 （4）镜检 先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。若用油镜 观察，盖玻片厚度不能超过0.17nm，并要十分细心，以免压碎盖玻片、损伤镜头。 观察过程要在略暗的光线下进行。 实验四 酵母菌的形态观察及死、活细胞的鉴别
（4）制片 取一滴菌液于载玻片上的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用 吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温（或37℃）自然干燥。 干后应尽快染色，不宜放置时间过长。 （5）染色 涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3-5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B 液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水 冲洗。若加B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。 配制合格的染色剂（尤其是B液）、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间均是 鞭毛染色成败的重要环节。 （6）镜检 干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的 一定部位观察到鞭毛。 菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。 2. 改良的Leifson氏染色法 （1）载玻片的准备、菌种材料的准备用硝酸银染色法。 （2）制片 用记号笔在载玻片反面将玻片分成3-4个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌 液。将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液。室温或37℃自然干燥。 （3）染色 加Leifson氏染色液覆盖第一区的涂面，隔数min后，加染液于第二涂面，如此 继续染第三、四区。间隔时间自行议定，其目的是为了确定最佳染色时间。在染色过程中仔细观 察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时，即直接用水轻轻冲洗（不要先倾去 染料再冲洗，否则背景不清）。染色时间大约10min。自然干燥。 （4）镜检干后用油镜观察。 菌体和鞭毛均呈红色。 （二）运动性观察 玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法。 1. 压滴法 （1）制片在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0.01％的美蓝 水溶液与其混合均匀。用镊子取一洁净的盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢 放下盖在菌液上。观察专性好氧菌时，可在放盖玻片时压入小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运 动。 （2）镜检 先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片厚 度不能超过0.17nm。观察时，要用略暗光线。 有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随 水流运动区别。 2. 悬滴法 （1）涂凡士林取洁净凹载玻片，在其四周涂少许凡士林。 （2）加菌液 在盖玻片中央滴一小滴菌液。为便于观察时寻找菌液位置，可用记号笔在菌 液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央。 （3）盖凹玻片 将凹玻片得凹槽对准盖玻片中心得菌液，并轻轻盖在盖玻片上。轻轻按压 使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液滴封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位 于凹槽中央。 若菌液加得过多，此时菌液就会流到凹玻片上面影响观察。 （4）镜检 先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。若用油镜 观察，盖玻片厚度不能超过0.17nm，并要十分细心，以免压碎盖玻片、损伤镜头。 观察过程要在略暗的光线下进行。 实验四 酵母菌的形态观察及死、活细胞的鉴别
一、 实验要求 1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死、活细胞的染色方法。 2. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、基本原理 酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化， 其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。繁殖方式也比较复杂，无性繁殖主要 是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢 子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片和水－碘水浸片来观察生活的酵母形态和 出芽生殖方式。 美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来 对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还 原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色， 而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱， 而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可以观察酵母的形态，还 可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。 三、器材 酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或卡尔酵母（S. calsbergensis）；0.05%， 0.1%吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片，盖玻片等。 四、操作步骤 1. 美蓝浸片观察 （1）在载玻片中央滴加 1 滴 0.1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少， 以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上 培养 48h 的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。 （2）用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖片时应注意，不能将盖玻片平 放上去，应先将盖玻片地一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以 避免产生气泡。 （3）将制好地水浸片放置 3min 后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观 察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。 （4）染色 0.5h 后，再观察一下死细胞数目是否增加。 （5）用 0.05％吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。 2. 水－碘浸片观察 在载玻片中央滴一滴革兰氏染色用的碘液，然后再在其上加三滴水，取酿酒 酵母少许，放在水－碘液滴中，使菌体与溶液混匀，盖上盖玻片后镜检。 实验五 细菌、放线菌、酵母及其它真菌菌落的比较及微观形态 观察 一、目的要求
一、 实验要求 1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死、活细胞的染色方法。 2. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、基本原理 酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化， 其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。繁殖方式也比较复杂，无性繁殖主要 是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢 子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片和水－碘水浸片来观察生活的酵母形态和 出芽生殖方式。 美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来 对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还 原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色， 而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱， 而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可以观察酵母的形态，还 可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。 三、器材 酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或卡尔酵母（S. calsbergensis）；0.05%， 0.1%吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片，盖玻片等。 四、操作步骤 1. 美蓝浸片观察 （1）在载玻片中央滴加 1 滴 0.1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少， 以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上 培养 48h 的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。 （2）用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖片时应注意，不能将盖玻片平 放上去，应先将盖玻片地一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以 避免产生气泡。 （3）将制好地水浸片放置 3min 后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观 察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。 （4）染色 0.5h 后，再观察一下死细胞数目是否增加。 （5）用 0.05％吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。 2. 水－碘浸片观察 在载玻片中央滴一滴革兰氏染色用的碘液，然后再在其上加三滴水，取酿酒 酵母少许，放在水－碘液滴中，使菌体与溶液混匀，盖上盖玻片后镜检。 实验五 细菌、放线菌、酵母及其它真菌菌落的比较及微观形态 观察 一、目的要求