常用的基本操作技术 （一）消毒和灭菌技术 消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。消毒一般 是指利用物理或化学方法消灭病原菌或有害微生物的营养体，而灭菌则是指利用 强烈的物理或化学方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。但日常生活中两 者常常通用。灭菌的方法很多，一般可分为物理灭菌和化学灭菌两大类。 1. 物理灭菌 物理灭菌是最常用的灭菌方法。主要包括热力学灭菌、过滤除菌和紫外线灭 菌等。 （1）热力学灭菌 又可分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。 ①干热灭菌 干热灭菌是利用高温使微生物的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内 的蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水 量越大，则蛋白质凝固就越快；含水量越小，凝固减慢。因此，与湿热灭菌相比， 干热灭菌所需温度更高（160~170℃），时间更长（1~2h）。进行干热灭菌时最 高温度不能超过 180℃，否则，包扎器皿的纸或棉塞就会被烤焦，甚至引起燃烧。 通常所说的干热灭菌是指利用干燥箱（或称烘箱）进行灭菌，主要用于玻璃器皿 如培养皿、移液管和接种工具等的灭菌。灭菌时将被灭菌的物体用双层报纸包好 或装入特制的灭菌筒内，装入箱中，不要摆的太挤，以免妨碍热空气流通。逐渐 加温，使温度上升至 160～170℃后保持 2h。灭菌结束后，切断电源，自然降温， 待箱内温度降至 70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。注意在温度降至 70℃以前切勿打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。 另外，灼烧灭菌也属于干热灭菌。在进行无菌操作时，接种工具如接种环、接 种钩、接种铲、镊子等要在酒精灯火焰上充分灼烧，试管口、菌种瓶口在火焰上作 短暂灼烧灭菌等。 ②湿热灭菌 a.高压蒸汽灭菌 此法是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通 过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从 排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了 灭菌器的压力，从而使沸点增高，得到高于 100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固 变性达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌 体吸收水分，蛋白质较易凝固，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大， 三是湿热的蒸汽有潜热存在。1g 水在 100℃时，由气态变为液态时可放出 2.26kJ 的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为 空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力 下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用 0.11MPa，121℃，20～30min 可达到彻底灭菌的目的。 这种灭菌适用于培养基、工作服、橡胶制品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的 灭菌
常用的基本操作技术 （一）消毒和灭菌技术 消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。消毒一般 是指利用物理或化学方法消灭病原菌或有害微生物的营养体，而灭菌则是指利用 强烈的物理或化学方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。但日常生活中两 者常常通用。灭菌的方法很多，一般可分为物理灭菌和化学灭菌两大类。 1. 物理灭菌 物理灭菌是最常用的灭菌方法。主要包括热力学灭菌、过滤除菌和紫外线灭 菌等。 （1）热力学灭菌 又可分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。 ①干热灭菌 干热灭菌是利用高温使微生物的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内 的蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水 量越大，则蛋白质凝固就越快；含水量越小，凝固减慢。因此，与湿热灭菌相比， 干热灭菌所需温度更高（160~170℃），时间更长（1~2h）。进行干热灭菌时最 高温度不能超过 180℃，否则，包扎器皿的纸或棉塞就会被烤焦，甚至引起燃烧。 通常所说的干热灭菌是指利用干燥箱（或称烘箱）进行灭菌，主要用于玻璃器皿 如培养皿、移液管和接种工具等的灭菌。灭菌时将被灭菌的物体用双层报纸包好 或装入特制的灭菌筒内，装入箱中，不要摆的太挤，以免妨碍热空气流通。逐渐 加温，使温度上升至 160～170℃后保持 2h。灭菌结束后，切断电源，自然降温， 待箱内温度降至 70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。注意在温度降至 70℃以前切勿打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。 另外，灼烧灭菌也属于干热灭菌。在进行无菌操作时，接种工具如接种环、接 种钩、接种铲、镊子等要在酒精灯火焰上充分灼烧，试管口、菌种瓶口在火焰上作 短暂灼烧灭菌等。 ②湿热灭菌 a.高压蒸汽灭菌 此法是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通 过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从 排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了 灭菌器的压力，从而使沸点增高，得到高于 100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固 变性达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌 体吸收水分，蛋白质较易凝固，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大， 三是湿热的蒸汽有潜热存在。1g 水在 100℃时，由气态变为液态时可放出 2.26kJ 的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为 空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力 下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用 0.11MPa，121℃，20～30min 可达到彻底灭菌的目的。 这种灭菌适用于培养基、工作服、橡胶制品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的 灭菌
b.常压蒸汽灭菌法 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种 常用的灭菌方法。对于不易用高压灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含 糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行 灭菌，也可用普通蒸汽笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过 100℃，仅能使大 多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭以杀 死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。 常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热 100℃，30min，连 续 3d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下 18~24h， 使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热 100℃，30min，发育的营养体又被 杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。 c.煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室 中煮沸消毒时间为 10～15min，可以杀死细菌所有营养体和部分芽孢。如延长煮 沸时间，并加入 1%碳酸氢钠或 2%～5%石炭酸，效果更好。人用注射器和手术器 械均采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌，或采用一次性无菌用品。 d.超高温杀菌 超高温杀菌(ultra high temperature sterilization，简称 UHTS) 是指在温度和时间标准分别为 130～150℃和 2～8s 的条件下对牛乳或其他液态 食品(如果汁及果汁饮料、豆乳、茶、酒及矿泉水等)进行处理的一种工艺，其最 大优点是既能杀死产品中的微生物，又能较好地保持食品品质与营养价值。超高 温杀菌工艺地应用，使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理想变成了现实。从而打 破了地域和季节地限制。 超高温杀菌是自 80 年代以来已在世界各国广泛应用。我国改革开放以来， 超高温杀菌也广泛应用于橘子汁、猕猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生产。 （2）过滤除菌 许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热灭菌消毒灭菌 方法，均会被热破坏，因此可以采用过滤除菌方法。应用最广泛的过滤器有： ①蔡氏(Seitz)过滤器 该滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属 (银或铝)漏斗组成，分上、下两节，过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两 节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其 孔径大小滤板分为三种型号：K 型最大，作一般澄清用；EK 滤孔较小，用来除去 一般细菌；EK-S 滤孔最小，可阻止大病毒通过，使用时可根据需要选用。 ②微孔滤膜过滤器 这是一种新型过滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤 维酯的混合物制成的薄膜。孔径分 0.025，0.05，0.10，0.20，0.30，0.45，0.60， 0.80，1.00，2.00，3.00，5.00，7.00，8.00 和 10.00μm。过滤时，液体和小 分子物质通过，细菌则被截留在滤膜上。实验室中用于除菌的滤膜孔径一般为 0.22μm，但若要将病毒除掉，则需要更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜不仅可以 用于除菌，还可以用来测定液体或气体中的微生物，如水的微生物检查。 过滤除菌法应用十分广泛，除实验室用于某些溶液，试剂的除菌外，在微生物 工业上所用的大量无菌空气及微生物工作使用的净化工作台，都是根据过滤除菌的 原理设计的。 （3）辐射灭菌 紫外线波长在 200～300nm，具有杀菌作用，其中以 265～ 266nm 杀菌力最强。此波长的紫外线易被细胞中核酸吸收，造成细胞损伤而杀菌， 紫外线灭菌在微生物工作及生产实践中应用较广，无菌室或无菌接种箱空气可用 紫外线灯照射灭菌。此外，采用 60Co-γ射线灭菌。也已广泛用于不能进行加热 灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。 γ射线灭菌的最大优点是：穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌
b.常压蒸汽灭菌法 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种 常用的灭菌方法。对于不易用高压灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含 糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行 灭菌，也可用普通蒸汽笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过 100℃，仅能使大 多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭以杀 死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。 常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热 100℃，30min，连 续 3d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下 18~24h， 使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热 100℃，30min，发育的营养体又被 杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。 c.煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室 中煮沸消毒时间为 10～15min，可以杀死细菌所有营养体和部分芽孢。如延长煮 沸时间，并加入 1%碳酸氢钠或 2%～5%石炭酸，效果更好。人用注射器和手术器 械均采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌，或采用一次性无菌用品。 d.超高温杀菌 超高温杀菌(ultra high temperature sterilization，简称 UHTS) 是指在温度和时间标准分别为 130～150℃和 2～8s 的条件下对牛乳或其他液态 食品(如果汁及果汁饮料、豆乳、茶、酒及矿泉水等)进行处理的一种工艺，其最 大优点是既能杀死产品中的微生物，又能较好地保持食品品质与营养价值。超高 温杀菌工艺地应用，使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理想变成了现实。从而打 破了地域和季节地限制。 超高温杀菌是自 80 年代以来已在世界各国广泛应用。我国改革开放以来， 超高温杀菌也广泛应用于橘子汁、猕猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生产。 （2）过滤除菌 许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热灭菌消毒灭菌 方法，均会被热破坏，因此可以采用过滤除菌方法。应用最广泛的过滤器有： ①蔡氏(Seitz)过滤器 该滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属 (银或铝)漏斗组成，分上、下两节，过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两 节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其 孔径大小滤板分为三种型号：K 型最大，作一般澄清用；EK 滤孔较小，用来除去 一般细菌；EK-S 滤孔最小，可阻止大病毒通过，使用时可根据需要选用。 ②微孔滤膜过滤器 这是一种新型过滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤 维酯的混合物制成的薄膜。孔径分 0.025，0.05，0.10，0.20，0.30，0.45，0.60， 0.80，1.00，2.00，3.00，5.00，7.00，8.00 和 10.00μm。过滤时，液体和小 分子物质通过，细菌则被截留在滤膜上。实验室中用于除菌的滤膜孔径一般为 0.22μm，但若要将病毒除掉，则需要更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜不仅可以 用于除菌，还可以用来测定液体或气体中的微生物，如水的微生物检查。 过滤除菌法应用十分广泛，除实验室用于某些溶液，试剂的除菌外，在微生物 工业上所用的大量无菌空气及微生物工作使用的净化工作台，都是根据过滤除菌的 原理设计的。 （3）辐射灭菌 紫外线波长在 200～300nm，具有杀菌作用，其中以 265～ 266nm 杀菌力最强。此波长的紫外线易被细胞中核酸吸收，造成细胞损伤而杀菌， 紫外线灭菌在微生物工作及生产实践中应用较广，无菌室或无菌接种箱空气可用 紫外线灯照射灭菌。此外，采用 60Co-γ射线灭菌。也已广泛用于不能进行加热 灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。 γ射线灭菌的最大优点是：穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌
2.化学灭菌 化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌 的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子 等，只是阻抑细菌代谢机能；细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大 多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学 药品浓度的高低，处理微生物的时间长短，微生物的种类以及微生物所处的环境 等有关。 微生物实验室中常用的化学药品有 2%煤酚皂溶液（来苏尔），0.25%新洁尔 灭，0.1%升汞，3%~5%的甲醛溶液，75%乙醇溶液等。常用化学杀菌剂的配制见附 录四。 消毒与灭菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的重要环节 和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要 的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。 （二）无菌操作技术 在微生物的分离和培养过程中，必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作技术， 就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环 境中的杂菌进入培养的容器或系统内，避免污染培养物。无菌操作技术广泛应用 于微生物、组织培养及基因工程等领域。 无菌操作技术，简单的说就是在无菌环境中进行的操作，为保证获得纯净的 培养物，需要考虑各种因素的影响。无菌操作过程各个环节见下图： （1）培养基灭菌 一般采用高压灭菌，将培养基放在高压锅中，排净冷空气后，在 121℃灭菌 20～30min，保证培养基处于无菌状态。 （2）创造无菌接种环境 无菌操作必须在无菌条件下进行。常见的无菌场所有净化工作台、接种箱和 接种室。在进行操作前需将灭菌后的培养基以及接种用的酒精灯、工具等，放到 接种场所，然后采用物理或化学方法进行环境处理。 ①净化工作台 操作前用 75％的酒精棉球擦拭台面，然后打开紫外线灯照射消 毒，并打开风机吹 20～30min，将台面上含有杂菌的空气排除，保持台面处于无菌 状态。 ②接种箱 操作前按照每 m 3空间用 10～14ml 甲醛和 5～10g 高锰酸钾进行 混合熏蒸，熏蒸时间不少于 30min。或用市售气雾消毒剂进行熏蒸，每 m 3空间用 4～5g。接种箱中如有紫外线灯时，同时打开。 ③接种室 灭菌方法同接种箱。为避免药害，接种前可以喷洒甲醛用量 1/2 的氨水来中和残留的甲醛。 （3）手消毒 先用肥皂水洗手，再用 75％的酒精棉球擦拭手表面。 （4）工具灭菌 点燃酒精灯，将接种工具在酒精灯外焰上充分灼烧，杀死 工具表面附着的杂菌。工具灭菌后不得再接触台面。 （5）无菌操作（以转管为例） 左手拿一支母种和一支空白 PDA 培养基， 右手拿灭菌后的接种构，将两个棉塞同时拔掉，夹在右手的无名指和小拇指、小
2.化学灭菌 化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌 的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子 等，只是阻抑细菌代谢机能；细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大 多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学 药品浓度的高低，处理微生物的时间长短，微生物的种类以及微生物所处的环境 等有关。 微生物实验室中常用的化学药品有 2%煤酚皂溶液（来苏尔），0.25%新洁尔 灭，0.1%升汞，3%~5%的甲醛溶液，75%乙醇溶液等。常用化学杀菌剂的配制见附 录四。 消毒与灭菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的重要环节 和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要 的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。 （二）无菌操作技术 在微生物的分离和培养过程中，必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作技术， 就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环 境中的杂菌进入培养的容器或系统内，避免污染培养物。无菌操作技术广泛应用 于微生物、组织培养及基因工程等领域。 无菌操作技术，简单的说就是在无菌环境中进行的操作，为保证获得纯净的 培养物，需要考虑各种因素的影响。无菌操作过程各个环节见下图： （1）培养基灭菌 一般采用高压灭菌，将培养基放在高压锅中，排净冷空气后，在 121℃灭菌 20～30min，保证培养基处于无菌状态。 （2）创造无菌接种环境 无菌操作必须在无菌条件下进行。常见的无菌场所有净化工作台、接种箱和 接种室。在进行操作前需将灭菌后的培养基以及接种用的酒精灯、工具等，放到 接种场所，然后采用物理或化学方法进行环境处理。 ①净化工作台 操作前用 75％的酒精棉球擦拭台面，然后打开紫外线灯照射消 毒，并打开风机吹 20～30min，将台面上含有杂菌的空气排除，保持台面处于无菌 状态。 ②接种箱 操作前按照每 m 3空间用 10～14ml 甲醛和 5～10g 高锰酸钾进行 混合熏蒸，熏蒸时间不少于 30min。或用市售气雾消毒剂进行熏蒸，每 m 3空间用 4～5g。接种箱中如有紫外线灯时，同时打开。 ③接种室 灭菌方法同接种箱。为避免药害，接种前可以喷洒甲醛用量 1/2 的氨水来中和残留的甲醛。 （3）手消毒 先用肥皂水洗手，再用 75％的酒精棉球擦拭手表面。 （4）工具灭菌 点燃酒精灯，将接种工具在酒精灯外焰上充分灼烧，杀死 工具表面附着的杂菌。工具灭菌后不得再接触台面。 （5）无菌操作（以转管为例） 左手拿一支母种和一支空白 PDA 培养基， 右手拿灭菌后的接种构，将两个棉塞同时拔掉，夹在右手的无名指和小拇指、小
拇指和掌根之间，不可将棉塞放到台面上。拔掉棉塞后，试管口要在酒精灯火焰 上方 3～5cm 处，利用火焰封口，然后用接种构切取少量母种，迅速通过酒精灯 火焰，放到空白培养基斜面中央，轻压以防止滑动。最后塞好棉塞。 （6）培养 将接种后的菌种放到适宜的环境条件下培养。培养环境要注意 消毒，防止培养过程中杂菌侵染菌种。 （7）检查 培养过程中要经常检查菌丝生长情况，发现有杂菌污染的菌种 要及时挑出。 在进行微生物分离纯化以及其它无菌操作时，要有责任心，培养自己的无菌 意识，加强训练，提高熟练程度，降低污染率。 （三）菌种保藏技术 微生物菌种是宝贵的生物资源，对微生物学研究和微生物资源开发与利用具有 非常重要的价值，因此菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作，其基本任务是对 已经获得的纯种微生物菌种进行收集、整理、鉴定、评价、保存和供应等工作，随 着科技的进步和经济的发展，对微生物菌种资源的利用正在不断地扩大，菌种保藏 工作便显得更加重要。 菌种是一个国家的重要生物资源，也是许多微生物工厂首要的生产资料。所 以世界各国对微生物菌种的保藏都很重视，许多国家都成立了专门的菌种保藏机 构。如美国典型培养物保藏中心（ATCC）和美国农业部菌种保藏中心（ARS）， 我国主要有中国典型培养物保藏中心（CTCCCAS）和中国农业微生物菌种保藏 管理中心（ACCC）等。 1. 菌种保藏的目的 （1）在较长时间内保持菌种的生活能力。 （2）保持菌种在遗传、形态和生理上的稳定性，使菌种保持既有科学研究 的价值，又有工业价值的特征。 （3）保持菌种的纯度，使其免受其它微生物（包括病毒）的侵染。 2. 菌种保藏的原理 菌种保藏的原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等手段，降低微生物的新陈 代谢，抑制其生命活动，使其处于休眠状态。 3. 菌种保藏的方法 采用低温、干燥、饥饿、缺氧等手段可以降低微生物的生物代谢能力，所以， 菌种保藏的方法虽多，但都是根据这 4 个因素确定的。下列方法可根据实验室具 体条件和微生物的特性灵活选用。 （1）斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待微生物菌种充分生长后，用报纸 或牛皮纸包扎好，贴好标签，移至 1～5℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同。丝状真菌、放线菌以及有芽孢的细菌间 隔 4～6 个月转接 1 次，酵母菌 2 个月，细菌最好每月转接 1 次。 此法是实验室和工厂菌种室常用的保藏法。优点是操作简单，使用方便，不 需特殊设备。缺点是长期保藏时需要多次转接，容易退化变异。同时，多次转接 污染杂菌的机会也会增加。 1 培养基选择 保藏细菌时多用牛肉膏—蛋白胨培养基，保藏放线菌时多用 高氏 1 号培养基，保藏丝状真菌时多用 PDA 培养基或完全培养基（葡萄糖 20g， 蛋白胨 2g，酵母膏 2g，硫酸镁 0.5g，磷酸二氢钾 0.46g，磷酸氢二钾 1g，维生
拇指和掌根之间，不可将棉塞放到台面上。拔掉棉塞后，试管口要在酒精灯火焰 上方 3～5cm 处，利用火焰封口，然后用接种构切取少量母种，迅速通过酒精灯 火焰，放到空白培养基斜面中央，轻压以防止滑动。最后塞好棉塞。 （6）培养 将接种后的菌种放到适宜的环境条件下培养。培养环境要注意 消毒，防止培养过程中杂菌侵染菌种。 （7）检查 培养过程中要经常检查菌丝生长情况，发现有杂菌污染的菌种 要及时挑出。 在进行微生物分离纯化以及其它无菌操作时，要有责任心，培养自己的无菌 意识，加强训练，提高熟练程度，降低污染率。 （三）菌种保藏技术 微生物菌种是宝贵的生物资源，对微生物学研究和微生物资源开发与利用具有 非常重要的价值，因此菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作，其基本任务是对 已经获得的纯种微生物菌种进行收集、整理、鉴定、评价、保存和供应等工作，随 着科技的进步和经济的发展，对微生物菌种资源的利用正在不断地扩大，菌种保藏 工作便显得更加重要。 菌种是一个国家的重要生物资源，也是许多微生物工厂首要的生产资料。所 以世界各国对微生物菌种的保藏都很重视，许多国家都成立了专门的菌种保藏机 构。如美国典型培养物保藏中心（ATCC）和美国农业部菌种保藏中心（ARS）， 我国主要有中国典型培养物保藏中心（CTCCCAS）和中国农业微生物菌种保藏 管理中心（ACCC）等。 1. 菌种保藏的目的 （1）在较长时间内保持菌种的生活能力。 （2）保持菌种在遗传、形态和生理上的稳定性，使菌种保持既有科学研究 的价值，又有工业价值的特征。 （3）保持菌种的纯度，使其免受其它微生物（包括病毒）的侵染。 2. 菌种保藏的原理 菌种保藏的原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等手段，降低微生物的新陈 代谢，抑制其生命活动，使其处于休眠状态。 3. 菌种保藏的方法 采用低温、干燥、饥饿、缺氧等手段可以降低微生物的生物代谢能力，所以， 菌种保藏的方法虽多，但都是根据这 4 个因素确定的。下列方法可根据实验室具 体条件和微生物的特性灵活选用。 （1）斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待微生物菌种充分生长后，用报纸 或牛皮纸包扎好，贴好标签，移至 1～5℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同。丝状真菌、放线菌以及有芽孢的细菌间 隔 4～6 个月转接 1 次，酵母菌 2 个月，细菌最好每月转接 1 次。 此法是实验室和工厂菌种室常用的保藏法。优点是操作简单，使用方便，不 需特殊设备。缺点是长期保藏时需要多次转接，容易退化变异。同时，多次转接 污染杂菌的机会也会增加。 1 培养基选择 保藏细菌时多用牛肉膏—蛋白胨培养基，保藏放线菌时多用 高氏 1 号培养基，保藏丝状真菌时多用 PDA 培养基或完全培养基（葡萄糖 20g， 蛋白胨 2g，酵母膏 2g，硫酸镁 0.5g，磷酸二氢钾 0.46g，磷酸氢二钾 1g，维生
素 B10.5 毫 g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL）。一般来说，菌种保藏适于用营养较 为瘠薄的培养基，因为这样可以降低生物的代谢，从而延长每次转接之间的间隔 时间。 2 斜面长度 用于保藏菌种的培养基斜面要求适当短些，这样培养基厚一 点，培养基中水分蒸发较少，可以保藏更长的时间。一般斜面长度占试管总长的 1/3。 3 培养物要有重复 这是防止菌种丧失的最有效的方法。一般每个菌株至少 保藏 3 管。 4 环境湿度 要防止冰箱中空气湿度过高而导致棉塞发霉。 5 特殊菌种 对于某些对低温特别敏感的菌种，只能在较高的温度下保藏。 如草菇菌种最好在 10～15℃下保藏。 （2）液体石蜡保藏法 在培养好的斜面菌种或穿刺培养的菌种表面覆盖灭菌后的液体石蜡，以减少 培养基中水分的蒸发和阻止氧气进入，从而达到长期保藏的目的。 将液体石蜡分装于三角瓶中，在 0.11～0.14MPa（温度 121～126℃）下灭菌 30min，然后放在 40℃温箱中，使水汽蒸发掉（由浑浊变澄清），备用。 将需要保藏的菌种，在适宜的培养基中培养，得到健壮的菌体或孢子。 在无菌条件下，用灭菌吸管吸取灭菌后的液体石蜡，注入长好菌的斜面上， 其用量以高出斜面顶端 1cm 为准（图 1. 4），使菌种与空气隔绝。将试管直立， 置低温或室温下保藏。 此法实用而且效果好，保藏丝状真菌、放线菌和芽孢细菌 2 年以上不会死亡， 酵母菌也可以保藏 1～2 年，一般无芽孢的细菌也可保藏 1 年以上。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，而且不 需经常转接。缺点是必须直立放置，所占空间较大，同时 携带也不方便。转接后由于菌体表面带有石蜡，所以第 1 次转接后往往生长较差，需进行第 2 次转接。 要注意以下事项： 1 为防止棉塞发霉，可以用消毒过的橡皮塞换掉棉塞。 2 要在斜面露出液面时及时补充无菌石蜡。 3 移接后灼烧接种钩（环）时培养物容易与残存石 蜡一起飞溅，要特别注意安全。 （3）滤纸保藏法 将微生物的孢子吸附在滤纸上，干燥后进行保藏的方法，称为滤纸保藏法。 将滤纸剪成 0.5×1.2cm 的小纸条，装入 0.6×8cm 小试管中，加上棉塞，在 0.11~0.14MPa（温度 121~126℃）下灭菌 30min，备用。 收集孢子，使孢子吸附在灭菌后的滤纸条上，重新放入试管中，塞好棉塞后 放在干燥器中干燥 1~2d，除去滤纸条上多余的水分（保存滤纸条的合适含水量 为 2%），试管上部用火熔封，贴好标签，放在冰箱中保藏。 丝状真菌、酵母、放线菌、细菌均可采用此法保藏，可保藏 2 年以上。辛登 （Singden.J.w）于 1932 年在滤纸上保藏的双孢菇孢子，到 1968 年检查时，仍有 活力。此法较液氮超低温保藏法、真空冷冻干燥保藏法简便易行，不需特殊设备。 （4）砂土管保藏法 取干净河沙加入 10%稀盐酸，加热煮沸 30min，以去除其中的有机质。倒去 盐酸后用自来水冲洗至中性，烘干，用 40 目筛除去粗颗粒后，装入 1×10cm 的 图 1.4 液体石蜡覆盖保藏法
素 B10.5 毫 g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL）。一般来说，菌种保藏适于用营养较 为瘠薄的培养基，因为这样可以降低生物的代谢，从而延长每次转接之间的间隔 时间。 2 斜面长度 用于保藏菌种的培养基斜面要求适当短些，这样培养基厚一 点，培养基中水分蒸发较少，可以保藏更长的时间。一般斜面长度占试管总长的 1/3。 3 培养物要有重复 这是防止菌种丧失的最有效的方法。一般每个菌株至少 保藏 3 管。 4 环境湿度 要防止冰箱中空气湿度过高而导致棉塞发霉。 5 特殊菌种 对于某些对低温特别敏感的菌种，只能在较高的温度下保藏。 如草菇菌种最好在 10～15℃下保藏。 （2）液体石蜡保藏法 在培养好的斜面菌种或穿刺培养的菌种表面覆盖灭菌后的液体石蜡，以减少 培养基中水分的蒸发和阻止氧气进入，从而达到长期保藏的目的。 将液体石蜡分装于三角瓶中，在 0.11～0.14MPa（温度 121～126℃）下灭菌 30min，然后放在 40℃温箱中，使水汽蒸发掉（由浑浊变澄清），备用。 将需要保藏的菌种，在适宜的培养基中培养，得到健壮的菌体或孢子。 在无菌条件下，用灭菌吸管吸取灭菌后的液体石蜡，注入长好菌的斜面上， 其用量以高出斜面顶端 1cm 为准（图 1. 4），使菌种与空气隔绝。将试管直立， 置低温或室温下保藏。 此法实用而且效果好，保藏丝状真菌、放线菌和芽孢细菌 2 年以上不会死亡， 酵母菌也可以保藏 1～2 年，一般无芽孢的细菌也可保藏 1 年以上。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，而且不 需经常转接。缺点是必须直立放置，所占空间较大，同时 携带也不方便。转接后由于菌体表面带有石蜡，所以第 1 次转接后往往生长较差，需进行第 2 次转接。 要注意以下事项： 1 为防止棉塞发霉，可以用消毒过的橡皮塞换掉棉塞。 2 要在斜面露出液面时及时补充无菌石蜡。 3 移接后灼烧接种钩（环）时培养物容易与残存石 蜡一起飞溅，要特别注意安全。 （3）滤纸保藏法 将微生物的孢子吸附在滤纸上，干燥后进行保藏的方法，称为滤纸保藏法。 将滤纸剪成 0.5×1.2cm 的小纸条，装入 0.6×8cm 小试管中，加上棉塞，在 0.11~0.14MPa（温度 121~126℃）下灭菌 30min，备用。 收集孢子，使孢子吸附在灭菌后的滤纸条上，重新放入试管中，塞好棉塞后 放在干燥器中干燥 1~2d，除去滤纸条上多余的水分（保存滤纸条的合适含水量 为 2%），试管上部用火熔封，贴好标签，放在冰箱中保藏。 丝状真菌、酵母、放线菌、细菌均可采用此法保藏，可保藏 2 年以上。辛登 （Singden.J.w）于 1932 年在滤纸上保藏的双孢菇孢子，到 1968 年检查时，仍有 活力。此法较液氮超低温保藏法、真空冷冻干燥保藏法简便易行，不需特殊设备。 （4）砂土管保藏法 取干净河沙加入 10%稀盐酸，加热煮沸 30min，以去除其中的有机质。倒去 盐酸后用自来水冲洗至中性，烘干，用 40 目筛除去粗颗粒后，装入 1×10cm 的 图 1.4 液体石蜡覆盖保藏法