《厦门大学学报（自然科学版）》：多肽18F标记方法研究进展（杨鸿章、牟钊彪、李子婧）

doi:106043/issn.0438-0479202005009 多肽1F标记方法研究进展 杨鸿章,牟钊彪,李子婧 厦门大学公共卫生学院分子影像暨转化医学研究中心,福建厦门361102) 摘要:正电子发射断层成像( positron emission tomography,PET)是高灵敏、可定量及无创的 活体分子成像方法,通过示踪表征特定生理功能或靶向病理标志物的正电子发射分子探针,可 对组织、器官的病变进行分子水平的探测与成像,从而实现疾病的早期诊断和实时监控。氟 18(18F)因其具有适宜成像的核素性质而被广泛用于PEI探针的标记。《随着PET的广泛应用 低兔疫原性和高亲和力的多肽作为PEr探针的靶向分子受到关注但由于多肽对高温、强酸 强碱、有机溶剂等标记条件相对较敏感,多肽的1F标记仍面临巨大挑战,与此同时新型标记 方法也层出不穷。本综述根据多肽的18F标记过程的复杂程度,即一步标记法、多步标记法和 固相标记法,分别举例阐述了F标记多肽代表性研究进展,并讨论了不同标记方法的特点 为标记多肽的合成、基础研究和临床研究提供孓参考 关键词:氟-18:18F标记方法;多肽;正电子发射探针 中图分类号:TL92+3 文献标志码:A 分子影像技术能反映机体组织x细胞及分子水平的代谢和功能状态的变化,不仅是疾病早 期诊断的利器,可为个体化治疗提供指导,在新药研发领域也有着巨大的应用前景2。其中, 正电子发射断层成像 positron emission tomography,PET通过正电子发射分子探针对体内组织器 官微观病变进行分水平的探测与成像,具有高灵敏度、无创、高穿透深度等优势,已广泛用 于肿瘤、神经系统及心血管系统等疾病的诊断和硏究。 表征特定生理功能或靶向病理标志物的正电子发射分子探针是PET成像的基础,通常由正 电子发射核素和高亲和性的配体组成。在能够发射正电子的放射性核素中,18F具有优良的核 素性质适用于医学成像,如:1)较低的最大正电子能量(635keV)使得正电子湮没前在组织中穿 行距离较短,从而提供较高分辨率的图像H5:2)半衰期(1098min)适中,可避免受试者长时间 内照射,但仍满足标记化学、体内显像和远程配送需求,广泛用于PEI探针的合成冏 多肽作为靶向特定受体的优良配体具有多种优势而受到了广泛的关注:1)特异性高、组织 穿透能力强;2)低分子量有利于多肽从血液和非靶组织中被快速清除,使得显像有较高的靶与 收稿日期:2020-05-12录用日期:2020-07-03 基金项目:国家自然科学基金(81971674);福建省自然科学基金(2019106006 通信作者:zijing.Iic@xmu.edu.cn

收稿日期：2020-05-12 录用日期：2020-07-03 基金项目：国家自然科学基金（81971674）；福建省自然科学基金（2019J06006） *通信作者：zijing.li@xmu.edu.cn doi: 10.6043/j.issn.0438-0479.202005009 ·综 述· 多肽 18F 标记方法研究进展 杨鸿章，牟钊彪，李子婧* （厦门大学公共卫生学院分子影像暨转化医学研究中心，福建 厦门 361102） 摘要：正电子发射断层成像（positron emission tomography，PET）是高灵敏、可定量及无创的 活体分子成像方法，通过示踪表征特定生理功能或靶向病理标志物的正电子发射分子探针，可 对组织、器官的病变进行分子水平的探测与成像，从而实现疾病的早期诊断和实时监控。氟 -18( 18F)因其具有适宜成像的核素性质而被广泛用于 PET 探针的标记。随着 PET 的广泛应用， 低免疫原性和高亲和力的多肽作为 PET 探针的靶向分子受到关注，但由于多肽对高温、强酸、 强碱、有机溶剂等标记条件相对较敏感，多肽的 18F 标记仍面临巨大挑战，与此同时新型标记 方法也层出不穷。本综述根据多肽的 18F 标记过程的复杂程度，即一步标记法、多步标记法和 固相标记法，分别举例阐述了 18F 标记多肽代表性研究进展，并讨论了不同标记方法的特点， 为 18F 标记多肽的合成、基础研究和临床研究提供了参考。 关键词：氟-18；18F标记方法；多肽；正电子发射探针 中图分类号：TL 92+3 文献标志码：A 分子影像技术能反映机体组织、细胞及分子水平的代谢和功能状态的变化，不仅是疾病早 期诊断的利器，可为个体化治疗提供指导，在新药研发领域也有着巨大的应用前景[1-2]。其中， 正电子发射断层成像(positron emission tomography，PET)通过正电子发射分子探针对体内组织器 官微观病变进行分子水平的探测与成像，具有高灵敏度、无创、高穿透深度等优势，已广泛用 于肿瘤、神经系统及心血管系统等疾病的诊断和研究。 表征特定生理功能或靶向病理标志物的正电子发射分子探针是 PET 成像的基础，通常由正 电子发射核素和高亲和性的配体组成[3]。在能够发射正电子的放射性核素中，18F 具有优良的核 素性质适用于医学成像，如：1）较低的最大正电子能量(635 keV)使得正电子湮没前在组织中穿 行距离较短，从而提供较高分辨率的图像[4-5]；2）半衰期(109.8 min)适中，可避免受试者长时间 内照射，但仍满足标记化学、体内显像和远程配送需求，广泛用于 PET 探针的合成[6]。 多肽作为靶向特定受体的优良配体具有多种优势而受到了广泛的关注：1）特异性高、组织 穿透能力强；2）低分子量有利于多肽从血液和非靶组织中被快速清除，使得显像有较高的靶与 厦门大学学报（自然科学版）

非靶比值;3)由于生物同源性,多肽一般不具有免疫原性,安全性较高。因此,如何用放射 性核素标记种类繁多的多肽进而制备出多肽探针,逐渐成为了疾病精准诊断和个性化治疗领域 的研究热点。目前,放射性标记多肽主要通过mrc、6Ga和1mLu等放射性金属标记,但是螯 合基团相对庞大可能影响多肽的靶向性,不适用于多肽放射性标记80。在过去的几年间,报 道了许多的新型1F标记多肽的方法,并在温和标记方面有重要发展。根据标记过程的复杂程 度可以系统地分为一步标记法、多步标记法和固相标记法。本文将分别对这些标记方法进行综 1一步18F标记多肽策略 11基于生成C-18F键的一步标记方法 基于CF键生成的一步F标记法按机理可分为亲电取代反应、亲核取代反应和自由基反 应。其中,基于CF键的1F亲电取代、亲核取代反应已被广泛地应用于小分子的标记,但它 们的标记条件往往较为苛刻,且多肽对高温、有机溶剂、强酸等反应条件较为敏感,因此基于 C-SF键生成的一步标记多肽方法的报道相对较少。而近年来开发的基于C-1F键生成的自由基 反应,标记条件较为温和、区域选择性好,应用前景阔 111基于芳香环亲电反应的一步18F标记多肽方法 在2003年, Ogawa等利用氟乙酰亲电取代的方式,在水相室温条件下成功实现了 c(RGDfMev的一步法标记(图1)该标记方法对多肽结构改变较小,因此多肽活性的影 响较小,但反应需要在三氟乙酸溶液中进行,不适合pH敏感的多肽的1F标记。此外,该反应 的化学选择性较差,在没有定位基团的情况下可出现多个标记产物,且比活度较低(328×10 GBq/umo),不适用于对比活度要求较高的受体显像 (i)[]AcOF,三氟乙酸,乙腈,室温。 图1基于芳香环亲电反应的一步18F标记多肽方法 Fig. I One-step F-labeling of peptides based on aromatic ring electrophilic reaction

非靶比值；3）由于生物同源性，多肽一般不具有免疫原性，安全性较高[7]。因此，如何用放射 性核素标记种类繁多的多肽进而制备出多肽探针，逐渐成为了疾病精准诊断和个性化治疗领域 的研究热点。目前，放射性标记多肽主要通过 99mTc、68Ga 和 177Lu 等放射性金属标记，但是螯 合基团相对庞大可能影响多肽的靶向性，不适用于多肽放射性标记[8-10]。在过去的几年间，报 道了许多的新型 18F 标记多肽的方法，并在温和标记方面有重要发展。根据标记过程的复杂程 度可以系统地分为一步标记法、多步标记法和固相标记法。本文将分别对这些标记方法进行综 述。 1 一步 18F 标记多肽策略 1.1 基于生成 C- 18F 键的一步标记方法 基于 C- 18F 键生成的一步 18F 标记法按机理可分为亲电取代反应、亲核取代反应和自由基反 应。其中，基于 C-F 键的 18F 亲电取代、亲核取代反应已被广泛地应用于小分子的标记，但它 们的标记条件往往较为苛刻，且多肽对高温、有机溶剂、强酸等反应条件较为敏感，因此基于 C- 18F 键生成的一步标记多肽方法的报道相对较少。而近年来开发的基于 C- 18F 键生成的自由基 反应，标记条件较为温和、区域选择性好，应用前景广阔。 1.1.1 基于芳香环亲电反应的一步 18F 标记多肽方法 在 2003 年，Ogawa 等[11]利用氟乙酰亲电取代的方式，在水相室温条件下成功实现了 c(RGDfMeV)的一步法 18F 标记（图 1）。该标记方法对多肽结构改变较小，因此多肽活性的影 响较小，但反应需要在三氟乙酸溶液中进行，不适合 pH 敏感的多肽的 18F 标记。此外，该反应 的化学选择性较差，在没有定位基团的情况下可出现多个标记产物，且比活度较低(3.28 × 10-2 GBq/μmol)，不适用于对比活度要求较高的受体显像。 (i) [ 18F]AcOF，三氟乙酸，乙腈，室温。 图 1 基于芳香环亲电反应的一步 18F 标记多肽方法 Fig. 1 One-step 18F-labeling of peptides based on aromatic ring electrophilic reaction 厦门大学学报（自然科学版）

112基于亲核反应的一步1F标记多肽方法 F]F的芳香亲核取代(SNA)是直接形成C(sp2)-F键常用标记方法,前体通常包含离去基 团,并在离去基团的对位或邻位带有活化基团(通常为强吸电子基团)。 Becaud等12报道了以 三甲基铵作为离去基团,用DMSO为反应溶剂在50℃下反应15mn,通过[F]F亲核取代反应 实现多肽的一步1F标记(图2a),经 radio-HPLC测定放射化学产率(RCY)为19%92% Jacobson等通过4-硝基-3-三氟甲基苯甲酰氯与c(RGDK)和二聚RGD肽F[c(RGDK)2偶联 利用微波反应在DMSO溶剂中130℃下加热反应35min,实现了以硝基为离去基团多肽的 步1F标记(图2b),其RCYs为7%-23%。基于亲核反应的一步1F标记往往需要在无水、高 温和有机溶剂等苛刻的条件下进行,因此不适用于敏感多肽的标记 0个一①个 AA= Arg Phe, Lys, Met Jacobson et al H2N. ()[FKF,DMSO,50℃,15min;(i)[F]KF,DMSO,130℃,3.5min。 图2基于亲核反应的一步1F标记多肽方法 Fig. 2 One-step F-labeling of peptides based on nucleophilic reaction 11.3基于自由基反应的一步18F标记多肽方法 2018年 Britton等报道了在紫外光(365mm)照射下,以十聚钨酸钠(NaDD为催化剂、[FN 氟苯磺酰亚胺( ISFJNFS为放射性氟源进行含亮氨酸多肽的1F标记(图3),其RCYs为 16%35%由于亮氨酸残基中的异丙基在光照及催化条件下倾向于生成稳定的三级碳自由基 在链转移过程中结合[FNFS中的F得到标记产物。该方法标记可以耐受水相介质,反应条 件较为温和、区域选择性好,其多肽中氨基、羧基等活性基团不需要提前保护,不需要借助标 记辅助基团,对多肽结构改变较小。但这种标记方法只适用于含有亮氨酸结构的多肽,且反应 时间相对较长,比活度较低(1.3×103~5.3×103GBq/μmol),不适用于对比活度要求较高的

1.1.2 基于亲核反应的一步 18F 标记多肽方法 [ 18F]F-的芳香亲核取代(SNAr)是直接形成 C(sp2 )- 18F 键常用标记方法，前体通常包含离去基 团，并在离去基团的对位或邻位带有活化基团（通常为强吸电子基团）。Becaud 等[12]报道了以 三甲基铵作为离去基团，用DMSO为反应溶剂在50 ℃下反应15 min，通过[ 18F]F-亲核取代反应 实现多肽的一步 18F 标记（图 2a），经 radio-HPLC 测定放射化学产率(RCY)为 19%~92%。 Jacobson等[13]通过4-硝基-3-三氟甲基苯甲酰氯与c(RGDfK)和二聚RGD肽E[c(RGDfK)]2偶联， 利用微波反应在 DMSO 溶剂中 130 ℃下加热反应 3.5 min，实现了以硝基为离去基团多肽的一 步 18F 标记（图 2b），其 RCYs 为 7%~23%。基于亲核反应的一步 18F 标记往往需要在无水、高 温和有机溶剂等苛刻的条件下进行，因此不适用于敏感多肽的标记。 (i) [ 18F]KF，DMSO，50 ℃，15 min；(ii) [ 18F]KF，DMSO，130 ℃，3.5 min。 图 2 基于亲核反应的一步 18F 标记多肽方法 Fig. 2 One-step 18F-labeling of peptides based on nucleophilic reaction 1.1.3 基于自由基反应的一步 18F 标记多肽方法 2018 年 Britton 等[14]报道了在紫外光(365 nm)照射下，以十聚钨酸钠(NaDT)为催化剂、[ 18F]N- 氟苯磺酰亚胺([18F]NFSI)为放射性氟源进行含亮氨酸多肽的 18F 标记（图 3），其 RCYs 为 16%~35%。由于亮氨酸残基中的异丙基在光照及催化条件下倾向于生成稳定的三级碳自由基， 在链转移过程中结合[ 18F]NFSI 中的 18F 得到标记产物。该方法标记可以耐受水相介质，反应条 件较为温和、区域选择性好，其多肽中氨基、羧基等活性基团不需要提前保护，不需要借助标 记辅助基团，对多肽结构改变较小。但这种标记方法只适用于含有亮氨酸结构的多肽，且反应 时间相对较长，比活度较低（1.3 ×10-3 ~5.3 ×10-3 GBq/μmol），不适用于对比活度要求较高的 厦门大学学报（自然科学版）

受体显像。 () FJNFSI,NaDT,乙腈,水,室温,40min。 图3基于自由基反应的一步18F标记多肽 Fig 3 One-step F-labeling of peptides based on free radical reaction 12基于生成Si8F键的一步标记方法 与CF键的键能(480kJ/mo)相比,SiF键具有更高的键能C>570k/mo),更稳定,于是基 于生成SiF键的标记方法引起了研究人员的广泛关注。1985年, Rosenthal等15首次将Si-18F 键引入到标记化学中,在乙腈水溶液(VF水=137)中,[F四甲基氟化铵与三甲基氯硅烷 反应得到三甲基氟硅烷,经过衰减校正后产率为80%大鼠吸入[F三甲基氟硅烷后,骨 骼中有明显的氟离子富集,表明[]三甲基氟硅烷在体内稳定性较差。但是该研究首次证明了 在含水介质亦可形成SiF键,打开了温和1标记的大门。之后, Hohne等161通过密度泛函 理论建立了有机氟硅烷水解的理论模型,发现通过增加围绕硅原子的空间位阻能提高 Si-I8F键」 的稳定性。以DMSO为反应溶剂,在3090℃条件下,羟基或氢为离去基团经[FJF亲核取代 反应合成了含有双功能官能团F标记的有机氟硅烷,RCYs为25%90%,并将其进一步与蛙皮 素肽偶联实现了多肽的F标记通过该法标记的多肽在体内外均有较好的稳定性,首次实现 了基于生成S"F键的多肽呷标记,但该方法通过两步实现多肽的标记,且标记条件相对 苛刻。 Schirrmacher等以叔丁基大位阻保护的叔丁基氟硅烷(SIFA)和奥曲肽通过肟键相连形成 SA多肽”作为标记前体,通过F同位素交换法在无水乙腈中室温下反应15mm实现 了SA多肽的一步标记(图4),RCYs为95%97%但当乙腈水溶液(Vz画水=14) 作为反应溶剂,该反应在室温下RCYs仅为5%,而在95℃下RCYs高达70%90%。该标记方 法需要过量的标记前体才能获得较高的RCYs,而标记产物无法通过化学方法与前体分离,因 此比活度较低

受体显像。 (i) [ 18F]NFSI，NaDT，乙腈，水，室温，40 min。 图 3 基于自由基反应的一步 18F 标记多肽 Fig. 3 One-step 18F-labeling of peptides based on free radical reaction 1.2 基于生成 Si- 18F 键的一步标记方法 与 C-F 键的键能(480 kJ/mol)相比，Si-F 键具有更高的键能(> 570 kJ/mol)，更稳定，于是基 于生成 Si- 18F 键的标记方法引起了研究人员的广泛关注。1985 年，Rosenthal 等[15]首次将 Si- 18F 键引入到标记化学中，在乙腈水溶液（V 乙腈:V 水 = 13:7）中，[ 18F]四甲基氟化铵与三甲基氯硅烷 反应得到[ 18F]三甲基氟硅烷，经过衰减校正后产率为 80%。大鼠吸入[ 18F]三甲基氟硅烷后，骨 骼中有明显的氟离子富集，表明[ 18F]三甲基氟硅烷在体内稳定性较差。但是该研究首次证明了 在含水介质亦可形成 Si- 18F 键，打开了温和 18F 标记的大门。之后，Höhne 等[16,17]通过密度泛函 理论建立了有机氟硅烷水解的理论模型，发现通过增加围绕硅原子的空间位阻能提高 Si- 18F 键 的稳定性。以 DMSO 为反应溶剂，在 30~90 ℃条件下，羟基或氢为离去基团经[ 18F]F -亲核取代 反应合成了含有双功能官能团 18F 标记的有机氟硅烷，RCYs 为 25%~90%，并将其进一步与蛙皮 素肽偶联实现了多肽的 18F 标记。通过该法标记的多肽在体内外均有较好的稳定性，首次实现 了基于生成 Si- 18F 键的多肽 18F 标记，但该方法通过两步实现多肽的 18F 标记，且标记条件相对 苛刻。Schirrmacher 等[18]以叔丁基大位阻保护的叔丁基氟硅烷(SiFA)和奥曲肽通过肟键相连形成 “SiFA-多肽”作为标记前体，通过 19F/ 18F 同位素交换法在无水乙腈中室温下反应 15 min 实现 了 SiFA-多肽的一步 18F 标记（图 4），RCYs 为 95%~97%。但当乙腈水溶液（V 乙腈:V 水 = 1:4） 作为反应溶剂，该反应在室温下 RCYs 仅为 5%，而在 95 ℃下 RCYs 高达 70%~90%。该标记方 法需要过量的标记前体才能获得较高的 RCYs，而标记产物无法通过化学方法与前体分离，因 此比活度较低。 厦门大学学报（自然科学版）

H 0. m。∥ HO- Method ii (i)PF]KF,乙腈,室温,10-15min:(i)PKF,乙腈,水,95℃,30min 图4基于Si-18F键一步18F标记多肽 Fig. 4 One-step 18F-labeled peptides based on Si-I8F bond SiF键的水解是该结构固有问题,但可以使用大位阻保护的方法来适当提高体内siF键 的稳定性,从而达到PT显像的要求。总之,S1F键为实现在部分水相溶剂中进行多肽的一步 法IF标记提供了一种可行的策略。 13基于生成B18F键的一步标记方法 BF键730Jm)是已知热力学最稳定的共价键之一。 Richard ting等以三氟硼酸盐为 标记前体,利用同位素交换法获得P基三氟硼酸盐,通过在芳基环上引入吸电子基团或利用 缺电子杂环取代苯环从而提高芳基三氟硼酸盐的水解稳定性。该方法的最大优点是能够在水 相介质中进行一步1F标记,从而避免了耗时且相对复杂的氟离子共沸干燥步骤。Liu等设计 出一系列三氟硼酸盐共轭物作为放射性药物标记前体,以p=2.0的50%DMF水溶液为反应 溶剂,在45℃的条件下反应15min(图5),实现了c(RGD等多肽的一步F标记

(i) [ 18F]KF，乙腈，室温，10~15min；（ii）[ 18F]KF，乙腈，水，95 ℃，30 min。 图 4 基于 Si- 18F 键一步 18F 标记多肽 Fig. 4 One-step 18F-labeled peptides based on Si- 18F bond Si-F 键的水解是该结构固有问题，但可以使用大位阻保护的方法来适当提高体内 Si- 18F 键 的稳定性，从而达到 PET 显像的要求。总之，Si-F 键为实现在部分水相溶剂中进行多肽的一步 法 18F 标记提供了一种可行的策略。 1.3 基于生成 B- 18F 键的一步标记方法 B-F 键(> 730 kJ/mol)是已知热力学最稳定的共价键之一。Richard Ting 等[19]以三氟硼酸盐为 标记前体，利用同位素交换法获得[ 18F]芳基三氟硼酸盐，通过在芳基环上引入吸电子基团或利用 缺电子杂环取代苯环从而提高[ 18F]芳基三氟硼酸盐的水解稳定性。该方法的最大优点是能够在水 相介质中进行一步 18F 标记，从而避免了耗时且相对复杂的氟离子共沸干燥步骤。Liu 等[20]设计 出一系列三氟硼酸盐共轭物作为放射性药物标记前体，以 pH = 2.0 的 50% DMF 水溶液为反应 溶剂，在 45 ℃的条件下反应 15 min（图 5），实现了 c(RGD)等多肽的一步 18F 标记[21]。 厦门大学学报（自然科学版）