《生命奥秘》：荧光蛋白技术的最新研究进展

生命奥秘 ww.lifeomics com 表4肿瘤成像的定量 表5大肠中GFP标记的肿瘤全身成像与活体内成像的比 肿瘤部位 像素 成像类型 肿瘤大小 荧光强度 GFP脑部 (像素) 912 6.00 RFP脑部 全身成像 2465 137 GFP骨 3561 23.42 剖开后成像 2731 GFP大肠 (全身成像) 2465 16.22 资料来源: Bio Techniques (活体内成像) 2731 1797 FP胰腺 RFP肝脏 2254 14.83 RFP胰腺 2510316515 资料来源: Bio Techniques 以上表明,在动物体内用GFP或RFP等标记的肿瘤能够发射出很强的信号,获得的图像可以很容易定 量,自发荧光的干扰可以忽略,并且可以用简单的低成本的设备进行GFP和RFP的全身成像 所有这些表明,荧光蛋白在肿瘤研究及体内高通量药物筛选等其它方面有广阔的应用前景。 参考文献 1. Anna-Katerina Hadjantonakis, Andras Nagy (2001)The color of mice: in the light of GFP-variant reporters, Histochem Cell Biol, 115: 49-58. 刘忠华,宋军,王报坤等CO8体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪科学通报5309:56560 Meng Yang, George Luiken, Eugene Baranov, et al.(2005)Facile whole-body imaging of internal fluorescent tumors in mice lashlight, Bio Techniques, 39: 170-172. 三、光蛋白技术的最新研究进展 1.新增荧光蛋白 在过去几年发展起来的荧光蛋白变体的荧光激发谱几乎覆盖了整个可见光的光谱范围。发色团周围环境 变化,如带电氨基酸残基的位置、氢键网络及蛋白间疏水作用等可能产生蓝色或红色光谱漂移,经吸收和 激发后最大可漂移40nm。更大的光谱漂移会产生新的光谱型荧光蛋白,如CFP、GFP、YFP等,这是由于发 色团共价结构和外部轨道连接的不同(图20、21)。人们进一步研究荧光蛋白发色团的复杂特性,找到了关 于多肽骨架结构与功能关系的线索,因此借助基因工程更精细的调整颜色变体,并扩大有用蛋白的光谱范围 就变得更加容易了。 18

生命奥秘 www.lifeomics.com 18 生命奥秘 www.lifeomics.com 18 表4 肿瘤成像的定量 表5 大肠中GFP标记的肿瘤全身成像与活体内成像的比较 肿瘤部位 像素 mm2 GFP 脑部 912 6.00 RFP 脑部 811 5.34 GFP 骨 3561 23.42 GFP 大肠 （全身成像） 2465 16.22 GFP 大肠 （活体内成像） 2731 17.97 GFP 胰腺 2813 18.51 RFP 肝脏 2254 14.83 RFP 胰腺 25103 165.15 成像类型 肿瘤大小 （像素） 荧光强度 全身成像 2465 137 剖开后成像 2731 196 资料来源：BioTechniques 资料来源：BioTechniques 以上表明，在动物体内用GFP或RFP等标记的肿瘤能够发射出很强的信号，获得的图像可以很容易定 量，自发荧光的干扰可以忽略，并且可以用简单的低成本的设备进行GFP和RFP的全身成像。 所有这些表明，荧光蛋白在肿瘤研究及体内高通量药物筛选等其它方面有广阔的应用前景。 1. Anna-Katerina Hadjantonakis, Andras Nagy. (2001) The color of mice: in the light of GFP-variant reporters, Histochem Cell Biol, 115:49-58. 2. 刘忠华, 宋军, 王振坤等. (2008) 体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪,科学通报, 53(5): 556-560. 3. Meng Yang, George Luiken, Eugene Baranov, et al. (2005) Facile whole-body imaging of internal fluorescent tumors in mice with an LED flashlight, BioTechniques, 39: 170-172. 三、 荧光蛋白技术的最新研究进展 1. 新增荧光蛋白 在过去几年发展起来的荧光蛋白变体的荧光激发谱几乎覆盖了整个可见光的光谱范围。发色团周围环境 的变化，如带电氨基酸残基的位置、氢键网络及蛋白间疏水作用等可能产生蓝色或红色光谱漂移，经吸收和 激发后最大可漂移40nm。更大的光谱漂移会产生新的光谱型荧光蛋白，如CFP、GFP、YFP等，这是由于发 色团共价结构和外部轨道连接的不同（图20、21）。人们进一步研究荧光蛋白发色团的复杂特性，找到了关 于多肽骨架结构与功能关系的线索，因此借助基因工程更精细的调整颜色变体，并扩大有用蛋白的光谱范围 就变得更加容易了。 参考文献

螺旋 β柱状结构 40A B-折叠(1) Thrs Serbs EGFP a螺旋 Gly67 y67 30A Tyr66 ales5→ T65 14)m2a b N-末端 C-末端 Aequorea victoria GFP突变图 (D234N T9G H231E L194 K79R Y39N D155V v11 N198s M153T B1a2「B3B1ro7<c S72A v150 Y66H W163A Y66W(Q69M-I S30R v224L V68L F46L S65T 167TA D19E 147L N149k) B T203Y H148D Y147P N105T s205T N146 (A206K-V 171v 145A-F 1128v s208F s175G E172T CFPs YFPs Shared 图20(a)荧光蛋白B-柱状结构及常见 Aequorea荧光蛋白衍生物的发色团结构。(1)BFP:(2)CFP;(3) EGFP;(4)YFP。(b) Aequorea victoria GFP突变图。β-折叠(绿色带有箭头的细柱状结构,箭头指向C-末 端,已编号为β-1~11),α-螺旋(灰色圆柱结构)。肽链拓扑结构图上标明了常见的突变。标记所用颜色代表 相应颜色的荧光蛋白,BFP(蓝色)、CFP(蓝绿色)、GFP(绿色)、YFP(黄色)、 Sapphire(紫色)、折 叠、共有及单体化(灰色)。图中可以看出,几乎75%的突变都发生在中心a-螺旋以及β-折叠7、8、10处 图片来源: Journal of Ce∥ Science 19

19 柱状结构 螺旋 BFP EGFP YFP CFP N-末端 C-末端 Aequorea victoria GFP突变图 螺旋 折叠 a b 图20 （a）荧光蛋白β-柱状结构及常见Aequorea荧光蛋白衍生物的发色团结构。（1）BFP；（2）CFP；（3） EGFP；（4）YFP。（b）Aequorea victoria GFP突变图。β-折叠（绿色带有箭头的细柱状结构，箭头指向C-末 端，已编号为β-1~11），α-螺旋（灰色圆柱结构）。肽链拓扑结构图上标明了常见的突变。标记所用颜色代表 相应颜色的荧光蛋白，BFP（蓝色）、CFP（蓝绿色）、GFP（绿色）、YFP（黄色）、Sapphire（紫色）、折 叠、共有及单体化（灰色）。图中可以看出，几乎75%的突变都发生在中心α-螺旋以及β-折叠7、8、10处。 图片来源：Journal of Cell Science

生命奥秘www.lifeomic cs. com a红色、黄色及橙色荧光蛋白的发色团结构变化 反式发色 eqFP611 顺式发色团 R66= Met, GIn, Thr, Cys =Glu Met63 Tyr67 (4) Zs Yellow 骨架被劈开 Orange b N-末端 C-末端 DsRed行生的突变图 2A残基(2253 V195T-V V71A Q182 K45R L124 CR17H (F124L-M s197 H162K 125R K163M v105L V22M K166 L174 (mRFPD(mCherry(mpur @Tomato(Shared)(oneme 图21(a)黄色、橙色及红色荧光蛋白的发色团结构变化。(1)源自 DsRed和其它造礁珊瑚的荧光蛋白有一个 顺式发色团,第66位残基可以是Met、Gn、Thr、Cys或Glu 来源于 Entacmaea quadricolor的红色变体 于F3它是有的新的呈发在面田的蛋酸基与打锐先成四数呢不再连到 团形成:(4) mOrange,也具有三环发色团,是由66位苏氨酸与前面羧基碳环化产生的部分连接的语唑价e (b) DsRed突变图。β-折叠(红褐色带有箭头的细圆柱结构,箭头指向C-末端,已编号为 a-螺旋 (灰色圆柱结构):肽链拓扑结构图上标明了突变,标记所用颜色代表相应颜色的荧光蛋白。mRFP1(红色) mcherry(蓝绿色)、 pLum(紫色)、 d Tomato(黄色)、共有突变(灰色)及单体化突变(绿色)。与围绕 Aequorea GFP发生基团的突变簇不同(图20b),红色荧光蛋白突变遍布整个序列。 图片来源: Journal of cell science

生命奥秘 www.lifeomics.com 20 生命奥秘 www.lifeomics.com 20 a 红色、黄色及橙色荧光蛋白的发色团结构变化 顺式发色团 骨架被劈开 DsRed衍生的突变图 eqFP611 mOrange 反式发色团 N-末端 C-末端 残基 图21 （a）黄色、橙色及红色荧光蛋白的发色团结构变化。（1）源自DsRed和其它造礁珊瑚的荧光蛋白有一个 顺式发色团，第66位残基可以是Met、Gln、Thr、Cys或Glu；（2）来源于Entacmaea quadricolor的红色变体 eqFP611，它是已知的唯一具有反式发色团的荧光蛋白；（3）来源于纽扣型珊瑚虫Zoanthus的ZsYellow，也称 为zFp538，它具有一种新的三环发色团，由66位赖氨酸残基与自身α-碳原子环化形成四氢吡啶环再连接到发色 团形成；（4）mOrange，也具有三环发色团，是由66位苏氨酸与前面羧基碳环化产生的部分连接的噁唑环； （b）DsRed突变图。β-折叠（红褐色带有箭头的细圆柱结构，箭头指向C-末端，已编号为β-1~11）、α-螺旋 （灰色圆柱结构）；肽链拓扑结构图上标明了突变，标记所用颜色代表相应颜色的荧光蛋白。mRFP1（红色）、 mCherry（蓝绿色）、mPlum（紫色）、dTomato（黄色）、共有突变（灰色）及单体化突变（绿色）。与围绕 Aequorea GFP发生基团的突变簇不同（图20b），红色荧光蛋白突变遍布整个序列。 图片来源：Journal of Cell Science b (1) (2) (4) (3)

2.各种荧光蛋白的最新研究进展 2.1蓝色和蓝绿色荧光蛋白 目前,虽然大多数研究人员把注意力集中于橙色到远红外光谱区域,但最近BFP和CFP变体在成像中 的应用潜力出人意料地受到研究人员的关注。虽然EBFP是 Aequorea GFP来源的最早的光谱变体之一,但 其亮度低、光稳定性差,使其很久以来没有引起多数研究者的注意。最近,有三个研究小组报道指出,改进 的蓝色 Aequorea荧光蛋白变体与EBFP相比,亮度和光敏感性有明显增强。这些新的变体被命名为 Azurite (石青或蓝铜矿)、强力增强型蓝色荧光蛋白2( strongly enhanced blue fluorescent protein2,SBFP2) 及EBFP2(图22a),它们第一次使得活细胞在蓝色光谱区域成功地长时间成像成为可能。即使这三种荧光 蛋白在高浓度的微环境中表现出很弱的二聚体特性,但是它们能够在与亚细胞定位的靶蛋白融合中有效地发 挥作用,并且它们能够很容易地通过滤光片设备与标准的BFP及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6- diamidino-2 phenylindole,DAP)一起成像。所有这些BFP变体都可以通过A206K突变改造成真正的单体,而且这种突变 不会影响它们的特性。更重要的是,亮度最强、光稳定性最强的蓝色荧光蛋白EBFP2(表6),是EGFP在活 细胞中FRET的很好的供体。 b p q 图22(a-1)单体荧光蛋白与靶蛋白融合蛋白的亚细胞定位。(a)EBFP2mito-N-7(人细胞色素C氧化酶∨亚 基:线粒体):(b) cErulean- paxillin-N-22(鸡:粘着斑);(c) mTFPI- actin-C-7(人B-肌动蛋白:丝 状肌动蛋白):(d) eMerald- keratin-N-17(人细胞角蛋白18:中间丝):(e)超折叠GFP- lamin B1-C-10 人核纤层蛋白B1:核被膜):(f) mEnus-Cx43-N-7(大鼠α-1间隙连接蛋白-43;间隙连接):(g)YPet- N-7(人微管相关蛋白:RP/EB家族):(h)mKo- Golgi-N-7(人B-1,4半乳糖基转移酶N-末端 R基复合体);(i) td Tomato- zyxin-N-7(人斑联蛋白:粘着斑) Tag RFP-tubulin-C-6 管蛋白:微管):(k) mCherry-vimentin-N-7(人波形蛋白:中间丝);() mPlum-a- actinin-N-19(人非肌 肉:细胞骨架);(mq) mEGFP与人组蛋白HB融合( mEGFP-H2B-N-6)。(m)间期:(n)前期:(o)前 中期:(p)中期:(q)后期。(图片来源: Journal of Cell Science)

21 图22 （a-l）单体荧光蛋白与靶蛋白融合蛋白的亚细胞定位。（a）EBFP2-mito-N-7（人细胞色素C氧化酶VIII亚 基；线粒体）；（b）mCerulean-paxillin-N-22（鸡；粘着斑）；（c）mTFP1-actin-C-7（人β-肌动蛋白；丝 状肌动蛋白）；（d）mEmerald-keratin-N-17（人细胞角蛋白18；中间丝）；（e）超折叠GFP-lamin B1-C-10 （人核纤层蛋白B1；核被膜）；（f）mVenus-Cx43-N-7（大鼠α-1间隙连接蛋白-43；间隙连接）；（g）YPet￾EB3-N-7（人微管相关蛋白；RP/EB家族）；（h）mKO-Golgi-N-7（人β-1, 4半乳糖基转移酶N-末端81个氨基 酸；高尔基复合体）；（i）tdTomato-zyxin-N-7（人斑联蛋白；粘着斑）；（j）TagRFP-tubulin-C-6（人α-微 管蛋白；微管）；（k） mCherry-vimentin-N-7（人波形蛋白；中间丝）；（l）mPlum-α-actinin-N-19（人非肌 肉；细胞骨架）; （m-q）mEGFP与人组蛋白H2B融合（mEGFP-H2B-N-6）。（m）间期；（n）前期；（o）前 中期；（p）中期；（q）后期。（图片来源：Journal of Cell Science） 2. 各种荧光蛋白的最新研究进展 2.1 蓝色和蓝绿色荧光蛋白 目前，虽然大多数研究人员把注意力集中于橙色到远红外光谱区域，但最近BFP和CFP变体在成像中 的应用潜力出人意料地受到研究人员的关注。虽然EBFP是Aequorea GFP来源的最早的光谱变体之一，但 其亮度低、光稳定性差，使其很久以来没有引起多数研究者的注意。最近，有三个研究小组报道指出，改进 的蓝色Aequorea荧光蛋白变体与EBFP相比，亮度和光敏感性有明显增强。这些新的变体被命名为Azurite （石青或蓝铜矿）、强力增强型蓝色荧光蛋白2（strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2） 及EBFP2（图22a），它们第一次使得活细胞在蓝色光谱区域成功地长时间成像成为可能。即使这三种荧光 蛋白在高浓度的微环境中表现出很弱的二聚体特性，但是它们能够在与亚细胞定位的靶蛋白融合中有效地发 挥作用，并且它们能够很容易地通过滤光片设备与标准的BFP及4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2- phenylindole, DAPI）一起成像。所有这些BFP变体都可以通过A206K突变改造成真正的单体，而且这种突变 不会影响它们的特性。更重要的是，亮度最强、光稳定性最强的蓝色荧光蛋白EBFP2（表6），是EGFP在活 细胞中FRET的很好的供体。 a b c d e f g h i j k l m n o p q

生命奥秘 ww.lifeomics com 蓝绿光谱区域(约470nm~500nm) 直是原始的 Aequorea ECFP(表 6)衍生物占优势,直到一个单体 的水鸭色(又称水鸭蓝,是蓝色与 a 绿色正中的颜色)变体mTFP1(图 副 22c)出现。这种荧光蛋白亮度更 强,具有酸不敏感性,而且光稳定 性更强。来源于四聚体软珊瑚蛋白 的mTFP1光谱特性与大多数CFP相 ((( 比,有稍微的红移,所以命名为水 鸭色而不是蓝绿色。与其它CFP不 同,mTFP1在发色团的第66位氨基 酸是酪氨酸而不是通常的色氨酸。 酪氨酸代替色氨酸,使得荧光激发 光谱宽度从大约60nm降低到更容易 操作的30nm,这样就降低了多色实 跟叫目目:3 验和FRET实验中的色度亮度干扰 效应。当蓝绿色荧光蛋白与黄色或 橙色荧光蛋白组合使用时,mTFP1 (表6)作为一个FRET的供体,就#‖菜湖3 至≌ 成为除了 mECEP和 m Cerulean(蔚 蓝色或天蓝色荧光蛋白)(图22b 表6)之外的一个极好的选择。虽然 2试可明别房而s2 说mTFP1需要特殊的滤光片设备来 成像,但是用标准的ECFP滤光片设 800=006@839“米实 备也能产生合适的信号水平。 最近,应用一种更好的点直接 突变方法进行ECFP和EYFP单体变 到别到 体的突变优化,以增强亮度、折叠 效率、可溶性及FRET性能。这样 就产生了超级蓝绿色和黄色荧光衍 生物,它们分别被命名为SCFP和 SYFP。在细菌中表达的这两种荧 2到到器引别别团别刻剧别民 光蛋白明显要比原荧光蛋白亮度更 强,但在哺乳动物细胞中表达的亮 度却比原荧光蛋白弱两倍。不过, 这些高性能的荧光蛋白应该有利于 求图担野野断抵捆 撼|裂显显照 融合标签,能够用来创造新的更先 进的且具有更大动态范围的CFP YEP FRET生物传感器,用来检测 aQE 代谢、pH变化、Ca波动、蛋白质 和酶磷酸化及其它细胞内的生物活 22

生 命 奥 秘 w w w . l i f e o m i c s . c o m 22 生 命 奥 秘 w w w . l i f e o m i c s . c o m 22 蓝 绿 光 谱 区 域 （ 约 4 7 0 n m ~ 5 0 0 n m ） 一 直 是 原 始 的 Aeq uorea E C F P （ 表 6 ） 衍 生 物 占 优 势 ， 直 到 一 个 单 体 的 水 鸭 色 （ 又 称 水 鸭 蓝 ， 是 蓝 色 与 绿 色 正 中 的 颜 色 ） 变 体 m T F P 1 （ 图 2 2 c ） 出 现 。 这 种 荧 光 蛋 白 亮 度 更 强 ， 具 有 酸 不 敏 感 性 ， 而 且 光 稳 定 性 更 强 。 来 源 于 四 聚 体 软 珊 瑚 蛋 白 的 m T F P 1 光 谱 特 性 与 大 多 数 C F P 相 比 ， 有 稍 微 的 红 移 ， 所 以 命 名 为 水 鸭 色 而 不 是 蓝 绿 色 。 与 其 它 C F P 不 同 ， m T F P 1 在 发 色 团 的 第 6 6 位 氨 基 酸 是 酪 氨 酸 而 不 是 通 常 的 色 氨 酸 。 酪 氨 酸 代 替 色 氨 酸 ， 使 得 荧 光 激 发 光 谱 宽 度 从 大 约 6 0 n m 降 低 到 更 容 易 操 作 的 3 0 n m ， 这 样 就 降 低 了 多 色 实 验 和 F R E T 实 验 中 的 色 度 亮 度 干 扰 效 应 。 当 蓝 绿 色 荧 光 蛋 白 与 黄 色 或 橙 色 荧 光 蛋 白 组 合 使 用 时 ， m T F P 1 （ 表 6 ） 作 为 一 个 F R E T 的 供 体 ， 就 成 为 除 了 m E C F P 和 m C e r u l e a n （ 蔚 蓝 色 或 天 蓝 色 荧 光 蛋 白 ） （ 图 2 2 b ， 表 6 ） 之 外 的 一 个 极 好 的 选 择 。 虽 然 说 m T F P 1 需 要 特 殊 的 滤 光 片 设 备 来 成 像 ， 但 是 用 标 准 的 E C F P 滤 光 片 设 备 也 能 产 生 合 适 的 信 号 水 平 。 最 近 ， 应 用 一 种 更 好 的 点 直 接 突 变 方 法 进 行 E C F P 和 E Y F P 单 体 变 体 的 突 变 优 化 ， 以 增 强 亮 度 、 折 叠 效 率 、 可 溶 性 及 F R E T 性 能 。 这 样 就 产 生 了 超 级 蓝 绿 色 和 黄 色 荧 光 衍 生 物 ， 它 们 分 别 被 命 名 为 S C F P 和 S Y F P 。 在 细 菌 中 表 达 的 这 两 种 荧 光 蛋 白 明 显 要 比 原 荧 光 蛋 白 亮 度 更 强 ， 但 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 表 达 的 亮 度 却 比 原 荧 光 蛋 白 弱 两 倍 。 不 过 ， 这 些 高 性 能 的 荧 光 蛋 白 应 该 有 利 于 融 合 标 签 ， 能 够 用 来 创 造 新 的 更 先 进 的 且 具 有 更 大 动 态 范 围 的 C F P - Y F P F R E T 生 物 传 感 器 ， 用 来 检 测 代 谢 、 p H 变 化 、 C a 2 + 波 动 、 蛋 白 质 和 酶 磷 酸 化 及 其 它 细 胞 内 的 生 物 活 动 。 蛋白 光谱型颜色 激发峰（nm） 发射峰（nm） 亮度 光稳定性 pKa 聚集状态 发色团 滤光装置 EBFP2 蓝色 383 448 18 55 5.3 弱二聚体 SHG DAPI/BFP ECFP 蓝绿色 433/445 475/503 13 64 4.7 弱二聚体 TWG CFP mCerulean 蓝绿色 433/445 475/503 27/24 36 4.7 单体 TWG CFP mTFP1 蓝绿-绿色 462 492 54 110 4.3 单体 AYG CFP mEGFP 绿色 488 507 34 174 6.0 单体 TYG FITC/GFP mEmerald 绿色 487 509 39 101 6.0 单体 TYG FITC/GFP sfGFP 绿色 485 510 54 157 5.5 弱二聚体 TYG FITC/GFP EYFP 黄色 514 527 51 60 6.9 弱二聚体 GYG FITF/YFP mVenus 黄色 515 528 53 15 6.0 单体 GYG FITC/YFP mCitrine 黄色 516 529 59 49 5.7 单体 GYG FITC/YFP YPet 黄色 517 530 80 49 5.6 弱二聚体 GYG FITC/YFP mKO 橙色 548 559 31 122 5.0 单体 CYG TRITC/DsRed tdTomato 橙色 554 581 95 98 4.7 T二聚体 MYG TRITC/DsRed TagRFP 橙色 555 584 48 37 <4.0 单体 MYG TRITC/DsRed mRFP1 红色 584 607 12.5 8.7 4.5 单体 QYG TxRed mCherry 红色 587 610 17 96 <4.5 单体 MYG TxRed mKate 远红外 588 635 15 166 6.0 单体 MYG TxRed mPlum 远红外 590 649 3.2 53 <4.5 单体 MYG TxRed 表6 常用荧光蛋白的物理属性 资料来源：Journal of Cell Science