第37卷第8期 中国中药杂志 Vol 37. Issue 8 2012年4月 ·综述· 中药鉴定学新技术新方法研究进展 陈士林”,郭宝林,张贵君2,严铸云3,罗光明,孙素琴3, 吴和珍°,黄林芳',庞晓慧',陈建波5 (1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所中草药物质基础与资源利 教育部重点实验室,北京100193 2.北京中医药大学中药学院,北京100102;3.成都中医药大学药学院,四川成都61113 4.江西中医学院,江西南昌330004;5.清华大学化学系,北京100084 6.湖北中医药大学,湖北武汉430065) [摘要]作者对近20年中药鉴定学研究和应用的新技术、新方法进行了综述,介绍和评述了每种技术或方法的原理、特 点、应用实例及发展方向,探讨了现有新技术在鉴定中的客观性和准确性。DNA条形码技术鉴定能力较强,在鉴定没有背景 信息的中药样品及在方法通用性和可数字化方面具有优势,应用前景广阔。光谱鉴定具有指纹特征性,在中药材及饮片的质 量管理和鉴定中具有一定的实用性。显微鉴定新技术、色谱鉴定、特定引物PCR标记鉴定、生物效应鉴定、DNA芯片以及仿生 技术等其他技术在特定中药鉴定中将发挥重要作用。 关键词]中药鉴定:分子鉴定:化学鉴定;性状鉴定;显微鉴定 中药材是中药饮片、中药提取物和中成药的原料,它的国,形成了中药鉴定学的基原、形态、显微和理化四大鉴定方 前端是药用植物、药用动物、药用矿物及其特定的药用部位,法体系。而后我国在显微鉴定方法中创新性地应用了粉末 或者称为中药材的基原。中药鉴定学研究的主要内容为中鉴定,目前薄层方法已成为理化方法的主流。中药材鉴定 药材及其基原的鉴定,包括鉴定方法和鉴定标准,有些鉴定是依据能够良好表征药材特殊性或特征性的性状,以有效而 方法可以沿用到饮片、提取物和中成药。中药材的准确鉴定准确地区别药材,特别是易混品和伪品。因此,方法的有效 是中医药事业运行和发展的基本环节,一直备受关注。国家性、准确性、便捷性和实用性是鉴定的新目标,而新技术、新 药品标准对中药材的基原、鉴定方法和质量标准进行了规方法、新的特征类型的引进和应用则是实现上述目标的重要 定,要求基原须准确无误,鉴定方法要实用有效,标准正确合途径,最终实现鉴定方法的客观化、数字化和网络化。 理。对于常用中药材的基原问题,科学家通过本草考证 本文对近20年发展起来的中药鉴定学新技术和新方法 产地、市场和临床用药情况调查,并主要依据分类学研究将进行了综述和总结。对各类技术、方法进行了介绍和评述, 来源物种确认(矿物药主要依据矿物学),限定了药用部位,并对其发展方向进行了展望 基本澄清了混乱,据此建立了国家相关药材标准。然而,药1分子鉴定技术 材市场处于动态变化中,基原变化和新的药材类型(如栽培 中药分子鉴定一般是指依据大分子(核酸和蛋白)特征 品进口品种新的中药材品种等)不断出现,鉴定研究工作的鉴定。按鉴定特征可分为核酸分子鉴定和蛋白质分子鉴 仍不能松懈。此外,我国民族药基原混乱问题至今仍未全面定两大类,由于中药样品的特殊性,核酸分子鉴定主要集中 解决,需要重视。 于DNA分子鉴定 随着人类对天然药物的认识和利用,形成了药物鉴定知1.,1DNA分子鉴定 识。中药材鉴定方法的发展则与中医药的发展同步,体现在 传统鉴定方法主要依据性状特征差异进行鉴定,而DNA 历代医药学典籍中。西方生药学鉴定方法于1930年引入中分子鉴定技术则依靠反映生物个体、居群或物种基因组中 [稿件编号20120116004 有差异特征的DNA片段来鉴定,不受环境饰变影响及经验 [基金项目]国家自然科学基金重点项目(8110090;卫生行业科的限制,在中药材品种鉴定上具有一定优越性。 研专项项目(200802043) 分子生物学技术的迅猛发展促进了DNA分子标记鉴定 通信作者]陈士林,博士生导师,从事中药资源学研究,T:技术的诞生、发展和在中药鉴定中的应用。中药DNA分子 DO. E-mail: suchen@ implad 鉴定经历了以RFLP,RAPD和 DNA barcoding技术为代表的 1043 o1994-2013CHinaAcademicJournalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
·综述· 中药鉴定学新技术新方法研究进展 陈士林1* ，郭宝林1 ，张贵君2 ，严铸云3 ，罗光明4 ，孙素琴5 ， 吴和珍6 ，黄林芳1 ，庞晓慧1 ，陈建波5 ( 1. 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 中草药物质基础与资源利用 教育部重点实验室，北京 100193; 2. 北京中医药大学 中药学院，北京 100102; 3. 成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137; 4. 江西中医学院，江西 南昌 330004; 5. 清华大学 化学系，北京 100084; 6. 湖北中医药大学，湖北 武汉 430065) ［摘要］ 作者对近 20 年中药鉴定学研究和应用的新技术、新方法进行了综述，介绍和评述了每种技术或方法的原理、特 点、应用实例及发展方向，探讨了现有新技术在鉴定中的客观性和准确性。DNA 条形码技术鉴定能力较强，在鉴定没有背景 信息的中药样品及在方法通用性和可数字化方面具有优势，应用前景广阔。光谱鉴定具有指纹特征性，在中药材及饮片的质 量管理和鉴定中具有一定的实用性。显微鉴定新技术、色谱鉴定、特定引物 PCR 标记鉴定、生物效应鉴定、DNA 芯片以及仿生 技术等其他技术在特定中药鉴定中将发挥重要作用。 ［关键词］ 中药鉴定; 分子鉴定; 化学鉴定; 性状鉴定; 显微鉴定 ［稿件编号］ 20120116004 ［基金项目］ 国家自然科学基金重点项目( 81130069) ; 卫生行业科 研专项项目( 200802043) ［通信 作 者］ * 陈 士 林，博 士 生导师，从事 中药资 源 学 研 究，Tel: ( 010) 62899700，E-mail: slchen@ implad. ac. cn 中药材是中药饮片、中药提取物和中成药的原料，它的 前端是药用植物、药用动物、药用矿物及其特定的药用部位， 或者称为中药材的基原。中药鉴定学研究的主要内容为中 药材及其基原的鉴定，包括鉴定方法和鉴定标准，有些鉴定 方法可以沿用到饮片、提取物和中成药。中药材的准确鉴定 是中医药事业运行和发展的基本环节，一直备受关注。国家 药品标准对中药材的基原、鉴定方法和质量标准进行了规 定，要求基原须准确无误，鉴定方法要实用有效，标准正确合 理［1］。对于常用中药材的基原问题，科学家通过本草考证、 产地、市场和临床用药情况调查，并主要依据分类学研究将 来源物种确认( 矿物药主要依据矿物学) ，限定了药用部位， 基本澄清了混乱，据此建立了国家相关药材标准。然而，药 材市场处于动态变化中，基原变化和新的药材类型( 如栽培 品、进口品种、新的中药材品种等) 不断出现，鉴定研究工作 仍不能松懈。此外，我国民族药基原混乱问题至今仍未全面 解决，需要重视。 随着人类对天然药物的认识和利用，形成了药物鉴定知 识。中药材鉴定方法的发展则与中医药的发展同步，体现在 历代医药学典籍中。西方生药学鉴定方法于 1930 年引入中 国，形成了中药鉴定学的基原、形态、显微和理化四大鉴定方 法体系。而后我国在显微鉴定方法中创新性地应用了粉末 鉴定，目前薄层方法已成为理化方法的主流［2］。中药材鉴定 是依据能够良好表征药材特殊性或特征性的性状，以有效而 准确地区别药材，特别是易混品和伪品。因此，方法的有效 性、准确性、便捷性和实用性是鉴定的新目标，而新技术、新 方法、新的特征类型的引进和应用则是实现上述目标的重要 途径，最终实现鉴定方法的客观化、数字化和网络化。 本文对近 20 年发展起来的中药鉴定学新技术和新方法 进行了综述和总结。对各类技术、方法进行了介绍和评述， 并对其发展方向进行了展望。 1 分子鉴定技术 中药分子鉴定一般是指依据大分子( 核酸和蛋白) 特征 的鉴定。按鉴定特征可分为核酸分子鉴定和蛋白质分子鉴 定两大类，由于中药样品的特殊性，核酸分子鉴定主要集中 于 DNA 分子鉴定［3］。 1. 1 DNA 分子鉴定 传统鉴定方法主要依据性状特征差异进行鉴定，而 DNA 分子鉴定技术则依靠反映生物个体、居群或物种基因组中具 有差异特征的 DNA 片段来鉴定，不受环境饰变影响及经验 的限制，在中药材品种鉴定上具有一定优越性。 分子生物学技术的迅猛发展促进了 DNA 分子标记鉴定 技术的诞生、发展和在中药鉴定中的应用。中药 DNA 分子 鉴定经历了以 RFLP，RAPD 和 DNA barcoding 技术为代表的 ·1043· 第 37 卷第 8 期 2012 年 4 月 Vol. 37，Issue 8 April，2012
第37卷第8期 Issue 8 2012年4月 中国中药杂志 3个阶段,形成了基于分子杂交信号、PCR扩增指纹、核酸序方法的稳定性和可重复性需要提高。引物进行简单限定进 列分析的三大DNA鉴定技术体系的。基于序列分析的DNA行扩增的方法要随行实验和比较,通用性差。因此,该类方 条形码技术是目前影响较大、应用较广泛的DNA鉴定技术。法较难满足良好的鉴定要求 1.1.1DNA条形码鉴定技术DNA条形码是指利用基因 特定引物的PCR标记技术:该类方法需要事先知道研 组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段作为物种标记究对象的DNA序列信息。如SCAR( sequencing characterized 而建立的一种新的生物鉴定方法,由加拿大分类学家 Paul amplified region,)是根据RAPD,AFLP,lSR等方法得到的差 Hebert于2003年首次提出。该方法通过筛选确定通用条异条带,进行测序,设计引物,获得特异鉴别条带。SsR(sim- 形码,建立条形码数据库和鉴定平台,通过生物信息学分析 ple sequence repeat)是依据已知研究对象简单重复序列类型 方法分析比对DNA数据,进而对物种进行鉴定。DNA条形以及两侧序列,用两侧序列作为引物,扩增其重复序列,根据 码鉴定快速准确、有望实现自动鉴定,是传统生物鉴定方法不同对象的重复次数不同获得不同长度的条带进行鉴定 的有效补充,因而受到了国内外学者的广泛关注,目前已成杨维泽等对dEST数据库中人参属植物人参、西洋参和三七 为物种鉴定和分类的研究热点阿。与其他分子鉴定方法相的EST序列进行搜索和SR引物设计,能有效扩增三七的 比,DNA条形码鉴定具有三大优势:鉴定结果可重复性良R序列∞;丹参也有相关的研究报道。位点特异性 好:方法通用性强;可构建统一数据库和鉴定平台,易于推广PCR鉴定( allele-specific diagnostic PCR)是对己知待鉴别中 和标准化。 药与混伪品基因序列进行比对分析,确定正品的特异性变异 近年来,中药DNA条形码鉴定研究得到快速发展。中位点,引物设计时将该位点互补碱基设计在引物3端最末端 国学者通过大样本量系统研究,于2010年提出将ⅣS2作为(或在靠近3‘端的2-6个碱基引入变异碱基,增强扩增的特 药用植物标准DNA条形码, psba-trnH作为S2的补充序异性),正品可扩增出含有特异性突变位点的基因扩增片段 列。同时,通过对 Genbank数据库中所有植物和动物Is2混伪品没有,从而实现中药材的真伪鉴别。该技术在石 序列的分析,发现ⅣS2不仅对植物具有较高的鉴定效率,对斛、整甲国、紫苏等中药材品种的鉴别中得到了广泛 动物的鉴定成功率也高达91.7%,进而建议ITS2可作为动应用,2010年版《中国药典》中也收录本方法为蕲蛇和乌梢 物通用条形码CO的补充序列。目前,mS2已成功应用于蛇的分子鉴定方法。 豆科等多个科属药用植物及药材鉴定。pb4mH序列11.3基于分子杂交的DNA分子技术RFIP( restriction 也在石斛属等药用植物鉴定中得到了较好应用。鉴于 fragment length polymorphisms)是依据序列差异并产生特定的 以上研究成果陈士林等建立了以S2为核心、pbmH限制性内切酶酶切位点,从而导致酶切片段长度的变化或片 为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以CO序段数量的增减,进行鉴定。该项技术首次应用到北沙参基原 列为核心、mS2为辅助序列的动物类药材DNA条形码鉴定植物珊瑚菜 Glehnia littoralis不同居群的鉴别,随后应用 体系,并编著《中药DNA条形码分子鉴定》一书。同时,为加到柴胡等药材或其基原植物的鉴别中。因该方法所需 快中药DNA条形码研究和应用步伐,中国医学科学院药用DNA的量较大,对DNA的质量要求较高,限制了其广泛应 植物研究所建立了药用植物DNA条形码数据库,数据库网用。在保留酶切方法,简化杂交技术的基础上建立了PCR 址为htp://ts2 plantidit. dnsalias.org/和htp:/ psbA-trnH-RFLP( PCR-restriction fragment length polymorphism)技术。目 plantidit. dnsalias.org/。随着数据库的充实和扩大,相信在不前己有灵芝叫、绞股蓝等药材的 PCR-RFLP鉴别方法。 久的将来,便可通过数据库对中药材进行快速检索和鉴定, DNA微阵列(DNA芯片)是将不同中药的特异性基因片 段作为探针,固定在支持物上制成芯片,通过待测药材的 1.1.2基于PCR的分子鉴定技术随机和简单限定引物的DNA与基因芯片上的基因片段发生互补结合,从而实现该中 PCR标记技术:该类技术不需要知道研究对象的DNA信息,药的鉴定。 Caries等利用基因芯片对几种有毒中药进行 采用随机引物对模板DNA进行扩增,如RAPD( random am-了鉴别,蔡佩欣将不同种属多态性片段的特异性寡核苷 plified polymorphism DNA), AP-PCR等;或对引物进行简单限探针制成芯片,建立了贝母类药材基因芯片检测方法;Yan- 定,如AFLP( amplified fragments length polymorphism),Bs- Bo Zhan等建立了16个不同种属石斛的检测基因芯片, SR( inter-simple sequence repeat),DALP( direct amplification of有效检测出《国药典》收载的5种石斛,并能检测复方中的 金钗石斛。DNA芯片技术具有高效、快速、准确的优势, morphism),TRAP( target region amplified polymorphisn)等。于芯片制作、检测仪器设备较昂贵 杂。因此在中药 目前主要用于生物遗传关系和多样性分析。在中药鉴材的鉴别应用受限。 别方面也有一些报道,如 PC Shaw等利用RAPD技术进行了1.2蛋白质标记技术 人参、西洋参、三七及其混伪品的鉴别研究。该类标记技1.2.1抗血清鉴别技术抗血清鉴别技术是利用中药含有 术可通过特异条带法和聚类分析法来实现中药材的鉴定,但的抗原性物质,如蛋白质、多糖等物质,制备特异性的抗体 o1994-2013CHinaAcademicJournalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
3 个阶段，形成了基于分子杂交信号、PCR 扩增指纹、核酸序 列分析的三大 DNA 鉴定技术体系［3］。基于序列分析的 DNA 条形码技术是目前影响较大、应用较广泛的 DNA 鉴定技术。 1. 1. 1 DNA 条形码鉴定技术 DNA 条形码是指利用基因 组中一段公认标准的、相对较短的 DNA 片段作为物种标记 而建立的一种新的生物鉴定方法，由加拿大分类学家 Paul Hebert 于 2003 年首次提出［4］。该方法通过筛选确定通用条 形码，建立条形码数据库和鉴定平台，通过生物信息学分析 方法分析比对 DNA 数据，进而对物种进行鉴定。DNA 条形 码鉴定快速准确、有望实现自动鉴定，是传统生物鉴定方法 的有效补充，因而受到了国内外学者的广泛关注，目前已成 为物种鉴定和分类的研究热点［5-7］。与其他分子鉴定方法相 比，DNA 条形码鉴定具有三大优势: 鉴定结果可重复性良 好; 方法通用性强; 可构建统一数据库和鉴定平台，易于推广 和标准化。 近年来，中药 DNA 条形码鉴定研究得到快速发展。中 国学者通过大样本量系统研究，于 2010 年提出将 ITS2 作为 药用植物标准 DNA 条形码，psbA-trnH 作为 ITS2 的补充序 列［8］。同时，通过对 GenBank 数据库中所有植物和动物 ITS2 序列的分析，发现 ITS2 不仅对植物具有较高的鉴定效率，对 动物的鉴定成功率也高达 91. 7% ，进而建议 ITS2 可作为动 物通用条形码 COI 的补充序列［9］。目前，ITS2 已成功应用于 豆科等多个科属药用植物及药材鉴定［10-15］。psbA-trnH 序列 也在石斛属等药用植物鉴定中得到了较好应用［16-24］。鉴于 以上研究成果，陈士林等［25］建立了以 ITS2 为核心、psbA-trnH 为补充序列的植物类药材 DNA 条形码鉴定体系和以 COI 序 列为核心、ITS2 为辅助序列的动物类药材 DNA 条形码鉴定 体系，并编著《中药 DNA 条形码分子鉴定》一书。同时，为加 快中药 DNA 条形码研究和应用步伐，中国医学科学院药用 植物研究所建立了药用植物 DNA 条形码数据库，数据库网 址为 http: / /its2-plantidit. dnsalias. org / 和 http: / /psbA-trnHplantidit. dnsalias. org /。随着数据库的充实和扩大，相信在不 久的将来，便可通过数据库对中药材进行快速检索和鉴定， 应用前景广阔。 1. 1. 2 基于 PCR 的分子鉴定技术 随机和简单限定引物的 PCR 标记技术: 该类技术不需要知道研究对象的 DNA 信息， 采用随机引物对模板 DNA 进行扩增，如 RAPD( random amplified polymorphism DNA) ，AP-PCR 等; 或对引物进行简单限 定，如 AFLP( amplified fragments length polymorphism) ［26］，ISSR( inter-simple sequence repeat) ，DALP( direct amplification of length polymorphism) ，SRAP( sequence related amplified polymorphism) ，TRAP( target region amplified polymorphism) 等［3］。 目前主要用于生物遗传关系和多样性分析［27-28］。在中药鉴 别方面也有一些报道，如 PC Shaw 等利用 RAPD 技术进行了 人参、西洋参、三七及其混伪品的鉴别研究［29］。该类标记技 术可通过特异条带法和聚类分析法来实现中药材的鉴定，但 方法的稳定性和可重复性需要提高。引物进行简单限定进 行扩增的方法要随行实验和比较，通用性差。因此，该类方 法较难满足良好的鉴定要求。 特定引物的 PCR 标记技术: 该类方法需要事先知道研 究对象的 DNA 序列信息。如 SCAR( sequencing characterized amplified region，) 是根据 RAPD，AFLP，ISSR 等方法得到的差 异条带，进行测序，设计引物，获得特异鉴别条带。SSR( simple sequence repeat) 是依据已知研究对象简单重复序列类型 以及两侧序列，用两侧序列作为引物，扩增其重复序列，根据 不同对象的重复次数不同获得不同长度的条带进行鉴定。 杨维泽等对 dbEST 数据库中人参属植物人参、西洋参和三七 的 EST 序列进行搜索和 SSR 引物设计，能有效扩增三七的 SSR 序列［30］; 丹参也有相关的研究报 道［31］。位 点 特 异 性 PCR 鉴定( allele-specific diagnostic PCR) 是对已知待鉴别中 药与混伪品基因序列进行比对分析，确定正品的特异性变异 位点，引物设计时将该位点互补碱基设计在引物 3'端最末端 ( 或在靠近 3'端的 2 ～ 6 个碱基引入变异碱基，增强扩增的特 异性) ，正品可扩增出含有特异性突变位点的基因扩增片段， 混伪品 没 有，从而实现中药材的真伪鉴别。该 技 术 在 石 斛［32］、鳖甲［33］、紫苏［34］等中药材品种的鉴别中得到了广泛 应用，2010 年版《中国药典》中也收录本方法为蕲蛇和乌梢 蛇的分子鉴定方法。 1. 1. 3 基于分子杂交的 DNA 分子技术 RFLP( restriction fragment length polymorphisms) 是依据序列差异并产生特定的 限制性内切酶酶切位点，从而导致酶切片段长度的变化或片 段数量的增减，进行鉴定。该项技术首次应用到北沙参基原 植物珊瑚菜 Glehnia littoralis 不同居群的鉴别［35］，随后应用 到柴胡［36］等药材或其基原植物的鉴别中。因该方法所需 DNA 的量较大，对 DNA 的质量要求较高，限制了其广泛应 用。在保留酶切方法，简化杂交技术的基础上建立了 PCRRFLP( PCR-restriction fragment length polymorphism) 技术。目 前已有灵芝［37］、绞股蓝［38］等药材的 PCR-RFLP 鉴别方法。 DNA 微阵列( DNA 芯片) 是将不同中药的特异性基因片 段作为探针，固定在支持物上制成芯片，通过待测药材的 DNA 与基因芯片上的基因片段发生互补结合，从而实现该中 药的鉴定。Caries 等［39］利用基因芯片对几种有毒中药进行 了鉴别，蔡佩欣［40］将不同种属多态性片段的特异性寡核苷 探针制成芯片，建立了贝母类药材基因芯片检测方法; YanBo Zhang 等［41］建立了 16 个不同种属石斛的检测基因芯片， 有效检测出《中国药典》收载的 5 种石斛，并能检测复方中的 金钗石斛。DNA 芯片技术具有高效、快速、准确的优势，但由 于芯片制作、检测仪器设备较昂贵，过程复杂。因此在中药 材的鉴别应用受限。 1. 2 蛋白质标记技术 1. 2. 1 抗血清鉴别技术 抗血清鉴别技术是利用中药含有 的抗原性物质，如蛋白质、多糖等物质，制备特异性的抗体， ·1044· 第 37 卷第 8 期 2012 年 4 月 Vol. 37，Issue 8 April，2012
第37卷第8期 中国中药杂志 Issue 8 2012年4月 采用免疫酶联吸附法(ELSA)或抗体酶免疫试验( SALA)等外光谱、荧光光谱、拉曼光谱等技术在中药材鉴定中也显露 免疫学测定方法鉴别中药。 Kitagawa tsunehiro等采用SAE-出其独特的优势。 IA法对半夏、茯苓等进行了鉴别,阿胶及其代用品也采用 中药材所含化学成分复杂,有些相似来源药材的光谱或 抗血清鉴别技术鉴别。 谱等化学指纹图谱差异很小,不易直接观察。因此,需要 1.2.2蛋白质电泳鉴别利用中药中所含蛋白质分子大借助化学计量学技术,对大量样本的化学指纹图谱进行统计 小、形状或所带电荷差异,通过电泳分离而鉴别中药的方法,分析,寻找出相似药材之间微小但是有规律的特定差异。主 常见有聚丙烯酰胺凝胶电泳( polyacrylamide gel electrophore-成分分析,SMCA,PISA,支持向量机、人工神经网络等多 sis,PAGE)和毛细管电泳( capillary electrophoresis,CE)。前种模式识别方法均可用于中药材化学指纹图谱的分析,从而 者有用于一些果实种子、动物类药材鉴别的实例 后者建立客观准确的药材鉴定方法 近年来在中药的鉴别研究中报道较多-n 2.1光谱鉴定技术 1.2.3同工酶鉴别技术同工酶鉴别技术是基于待鉴定中2.1.1中红外光谱鉴定技术红外光谱按照波长范围的不 药的同工酶( Isozyme)分子结构、活性和免疫原性等方面的特同可分为中红外光谱(MR)、近红外光谱(NR)和远红外光 异性,采用酶活性分析和电泳检测的技术,鉴定不同中药品谱(FIR),尤以中红外光谱技术最为成熟、应用最为广泛,是 种的方法。李明利用植物鲜叶中的过氧化物同工酶,成功鉴目前公认的化合物“指纹光谱”技术,也是各国药典普遍规定 别了当归及其混伪品欧当归、独活。也有报道用同工酶化合物鉴别的关键方法。红外光谱仪器技术和化学计量学 鉴别藤茎类药材。 方法促进了中红外光谱在复杂混合物鉴定和质量研究中的 1.2.4蛋白飞行时间质谱鉴定技术蛋白飞行时间质谱鉴应用,中药材鉴定即是其中重要的应用领域 定技术是利用飞行时间质谱、荧光标记技术,对中药所含肽 红外光谱具有极强的指纹特征性。混合物的红外光谱 和蛋白质种类和组成进行分析,从而鉴定不同中药材的一种为其所含成分的光谱特征叠加,混合物所含组分种类越多, 鉴定技术。王若光等用商品蛋白芯片结合飞行时间质谱的其红外光谱上各种谱峰的叠加就会越严重,导致不同混合物 方法,建立了地龙圆、羚羊角等动物类中药蛋白质/肽成的鉴别变得困难。在混合物红外光谱的解析过程中,会遇到 分质量指纹图谱的鉴别方法 与纯化合物红外光谱解析不同的难题。针对混合物红外光 1.3发展方向 谱解析的目的与难题,孙素琴等根据混合物红外光谱宏 经过20多年的研究和探索,分子鉴定技术在中药基原观指纹特征,建立了中药材“红外光谱三级鉴别法”,利用红 植物和药材鉴定方面取得了突出成绩。DNA条形码技术为外光谱、二阶导数红外光谱和二维相关红外光谱增强药材光 分子鉴定技术的新方向,在中药鉴定中已经表现出巨大的应谱特征,根据叠加峰进行成分解析,借助化学计量学统计方 用潜力,有望实现中药鉴定标准化和数字化。随着中药DNA法进行鉴定识别。该方法不仅可以准确鉴定不同的中药材 条形码鉴定研究的不断深入,以下几方面将逐渐成为今后研(不同来源和正伪品),还能实现不同生长环境、采收时间、加 究的热点:中药材DNA提取试剂盒以及PCR扩增试剂盒的工处理药材等的鉴定 研发;制定中药材DNA条形码鉴定的技术标准,完善条形码 中红外光谱用于中药材鉴定有着诸多优势:反映样品的 数据库和鉴定平台;建立DNA条形码转换为二维码的技术整体化学信息;多种附件技术的使用,可以实现各种形态样 标准,并将其推广应用到中药生产、流通和药品监管等领域。品的快速、无损检测,而且样品可无需分离提取等预处理过 当然,由于中药品种复杂多样,其他分子鉴定方法,如蛋白鉴程;与化学计量学结合,可在快速检测的基础上,实现快速鉴 定方法、基因芯片、特异引物PCR鉴定技术等,也将在中药定;仪器通用,操作简便,成本低,无污染。重复性好,可建立 材鉴定中发挥重要作用 统一规格的化学图谱库,用于检索和实现网络在线鉴定。但 2化学鉴定技术 使用图谱库进行鉴定具有一定的局限性,一方面,不同的采 中药化学鉴定的物质基础是其所含的化学成分组。中收、加工、处理等可能较大影响药材总体成分变化,另一方面 药材所含成分复杂多样,化学鉴定通常选择少数具特征的化很多近缘物种可能在图谱总体特征上变化较小,因此图谱库 学成分,或者以化学成分的整体构成特点作为鉴定依据。早需要尽可能涵盖药材各种成分变化的样品谱图,也需要根据 期的中药理化鉴定多依据一类成分具有的化学特性,如特定药材具体情况,采用二阶导数光谱、二维相关图谱、制备提取 的显色反应等。TC方法采用对照品、对照药材或对照提取物图谱或摘选特异区段比较等方法进行进一步鉴定。 物进行随行对照鉴定,得到应用和普及。随着色谱分离、分 中红外光谱已大量应用到中药材和中药饮片的鉴定中 析技术的发展,HPLC,GC,HPCE等方法及与光谱联用技术孙素琴等测试了200多种对照药材的红外光谱、二阶导数红 的发展,可更精细和准确地反映中药材化学组分数和量等特外光谱和二维相关红外光谱国。刘军等圆使用中红外光谱 征,成为中药材鉴定和质量控制的有效方法。而以混合组分法建立八角茴香及其伪品莽草和红茴香的鉴别方法。周群 整体特征分析见长的光谱技术如红外光谱、X射光谱、紫等圆也使用中红外光谱与二维相关光谱鉴别了药用西宁大 o1994-2013CHinaAcademicJournalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
采用免疫酶联吸附法( ELISA) 或抗体酶免疫试验( SAEIA) 等 免疫学测定方法鉴别中药。Kitagawa Tsunehiro 等采用 SAEIA 法对半夏、茯苓等进行了鉴别［42］，阿胶及其代用品也采用 抗血清鉴别技术鉴别［43］。 1. 2. 2 蛋白质电泳鉴别 利用中药中所含蛋白质分子大 小、形状或所带电荷差异，通过电泳分离而鉴别中药的方法， 常见有聚丙烯酰胺凝胶电泳( polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE) 和毛细管电泳( capillary electrophoresis，CE) 。前 者有用于一些果实种子、动物类药材鉴别的实例［44-45］。后者 近年来在中药的鉴别研究中报道较多［46-47］。 1. 2. 3 同工酶鉴别技术 同工酶鉴别技术是基于待鉴定中 药的同工酶( isozyme) 分子结构、活性和免疫原性等方面的特 异性，采用酶活性分析和电泳检测的技术，鉴定不同中药品 种的方法。李明利用植物鲜叶中的过氧化物同工酶，成功鉴 别了当归及其混伪品欧当归、独活［48］。也有报道用同工酶 鉴别藤茎类药材［49］。 1. 2. 4 蛋白飞行时间质谱鉴定技术 蛋白飞行时间质谱鉴 定技术是利用飞行时间质谱、荧光标记技术，对中药所含肽 和蛋白质种类和组成进行分析，从而鉴定不同中药材的一种 鉴定技术。王若光等用商品蛋白芯片结合飞行时间质谱的 方法，建立了地龙［50］、羚羊角［51］等动物类中药蛋白质/肽成 分质量指纹图谱的鉴别方法。 1. 3 发展方向 经过 20 多年的研究和探索，分子鉴定技术在中药基原 植物和药材鉴定方面取得了突出成绩。DNA 条形码技术为 分子鉴定技术的新方向，在中药鉴定中已经表现出巨大的应 用潜力，有望实现中药鉴定标准化和数字化。随着中药 DNA 条形码鉴定研究的不断深入，以下几方面将逐渐成为今后研 究的热点: 中药材 DNA 提取试剂盒以及 PCR 扩增试剂盒的 研发; 制定中药材 DNA 条形码鉴定的技术标准，完善条形码 数据库和鉴定平台; 建立 DNA 条形码转换为二维码的技术 标准，并将其推广应用到中药生产、流通和药品监管等领域。 当然，由于中药品种复杂多样，其他分子鉴定方法，如蛋白鉴 定方法、基因芯片、特异引物 PCR 鉴定技术等，也将在中药 材鉴定中发挥重要作用。 2 化学鉴定技术 中药化学鉴定的物质基础是其所含的化学成分组。中 药材所含成分复杂多样，化学鉴定通常选择少数具特征的化 学成分，或者以化学成分的整体构成特点作为鉴定依据。早 期的中药理化鉴定多依据一类成分具有的化学特性，如特定 的显色反应等。TLC 方法采用对照品、对照药材或对照提取 物进行随行对照鉴定，得到应用和普及。随着色谱分离、分 析技术的发展，HPLC，GC，HPCE 等方法及与光谱联用技术 的发展，可更精细和准确地反映中药材化学组分数和量等特 征，成为中药材鉴定和质量控制的有效方法。而以混合组分 整体特征分析见长的光谱技术，如红外光谱、X-衍射光谱、紫 外光谱、荧光光谱、拉曼光谱等技术在中药材鉴定中也显露 出其独特的优势。 中药材所含化学成分复杂，有些相似来源药材的光谱或 色谱等化学指纹图谱差异很小，不易直接观察。因此，需要 借助化学计量学技术，对大量样本的化学指纹图谱进行统计 分析，寻找出相似药材之间微小但是有规律的特定差异。主 成分分析，SIMCA，PLS-DA，支持向量机、人工神经网络等多 种模式识别方法均可用于中药材化学指纹图谱的分析，从而 建立客观准确的药材鉴定方法。 2. 1 光谱鉴定技术 2. 1. 1 中红外光谱鉴定技术 红外光谱按照波长范围的不 同可分为中红外光谱( MIR) 、近红外光谱( NIR) 和远红外光 谱( FIR) ，尤以中红外光谱技术最为成熟、应用最为广泛，是 目前公认的化合物“指纹光谱”技术，也是各国药典普遍规定 化合物鉴别的关键方法。红外光谱仪器技术和化学计量学 方法促进了中红外光谱在复杂混合物鉴定和质量研究中的 应用，中药材鉴定即是其中重要的应用领域。 红外光谱具有极强的指纹特征性。混合物的红外光谱 为其所含成分的光谱特征叠加，混合物所含组分种类越多， 其红外光谱上各种谱峰的叠加就会越严重，导致不同混合物 的鉴别变得困难。在混合物红外光谱的解析过程中，会遇到 与纯化合物红外光谱解析不同的难题。针对混合物红外光 谱解析的目的与难题，孙素琴等［52-58］根据混合物红外光谱宏 观指纹特征，建立了中药材“红外光谱三级鉴别法”，利用红 外光谱、二阶导数红外光谱和二维相关红外光谱增强药材光 谱特征，根据叠加峰进行成分解析，借助化学计量学统计方 法进行鉴定识别。该方法不仅可以准确鉴定不同的中药材 ( 不同来源和正伪品) ，还能实现不同生长环境、采收时间、加 工处理药材等的鉴定。 中红外光谱用于中药材鉴定有着诸多优势: 反映样品的 整体化学信息; 多种附件技术的使用，可以实现各种形态样 品的快速、无损检测，而且样品可无需分离提取等预处理过 程; 与化学计量学结合，可在快速检测的基础上，实现快速鉴 定; 仪器通用，操作简便，成本低，无污染。重复性好，可建立 统一规格的化学图谱库，用于检索和实现网络在线鉴定。但 使用图谱库进行鉴定具有一定的局限性，一方面，不同的采 收、加工、处理等可能较大影响药材总体成分变化，另一方面 很多近缘物种可能在图谱总体特征上变化较小，因此图谱库 需要尽可能涵盖药材各种成分变化的样品谱图，也需要根据 药材具体情况，采用二阶导数光谱、二维相关图谱、制备提取 物图谱或摘选特异区段比较等方法进行进一步鉴定。 中红外光谱已大量应用到中药材和中药饮片的鉴定中， 孙素琴等测试了 200 多种对照药材的红外光谱、二阶导数红 外光谱和二维相关红外光谱［55］。刘军等［59］使用中红外光谱 法建立八角茴香及其伪品莽草和红茴香的鉴别方法。周群 等［60］也使用中红外光谱与二维相关光谱鉴别了药用西宁大 ·1045· 第 37 卷第 8 期 2012 年 4 月 Vol. 37，Issue 8 April，2012
第37卷第8期 Issue 8 2012年4月 中国中药杂志 黄与伪品华北大黄。此外,红外光谱三级鉴别法还成功用于材,但该方法主观性强、特征性差。采用三维荧光光谱可 人参、阿胶阿、淫羊藿等多种中药材的鉴定 提供药材成分的更多信息,便于寻找不同物种药材的差异。 21.2近红外和拉曼光谱鉴定技术近红外光谱法也可用魏永巨等使用三维荧光光谱分别鉴别了白花前胡与紫 于中药材鉴别。由于存在谱图影响因素多、背景复杂、谱峰花前胡、山豆根与北豆根 重叠等限制,近红外光谱的谱图差异不仅源于化学成分的不 核磁共振谱、太赫兹光谱等其他光谱和波谱方法也用于 同,也可能源于粒度、密度等物理因素的变化。因此,样本间中药材的鉴别研究。秦海林等-使用核磁共振氢谱对天 化学差异较小时,近红外光谱主要用于物理性质一致的大量麻、黄连等药材进行了鉴别。陈艳江等使用太赫兹光谱 样本的统计分析,例如不同产地相同物种药材的识别以及药和支持向量机方法对炙甘草和生甘草、南柴胡和北柴胡、山 材中常量成分的定量分析,而在不同物种中药材鉴定方面应豆根和北豆根进行了鉴别。但是受到仪器成本等方面的限 用较少。刘浩等阿使用二维相关近红外光谱鉴别了香加皮制,这些方法的推广普及有一定的难度 和五加皮,沈海龙等的利用近红外漫反射光谱法鉴别了地2.1.5光谱鉴定技术的发展方向紫外光谱、荧光光谱和 骨皮和伪品荃皮、大青根皮 核磁共振谱的测试常需对药材进行提取分离处理,而红外光 拉曼光谱也是一种分子振动光谱,可以用于中药材的鉴谱和拉曼光谱可直接测试药材,拉曼光谱和近红外光谱对未 定,所提供的信息与中红外光谱具有互补性。若中药材含有经预处理的样品不需与仪器本身接触也可测试,还可通过光 可产生荧光的成分,可能导致无法观察到药材的拉曼信号,纤等方式进行原位在线检测。因受到荧光背景的干扰,很多 因此需要使用波长较长的激发光源(如波长为1064mm的中药材的拉曼光谱特征性较差,使其应用到中药材鉴定受 Nd:YAG激光)。孙素琴等圖首次使用傅里叶变换拉曼光谱限。近红外光谱技术适宜于物化性质近似的大量样本的统 仪直接测定了党参、茯苓、山药等23种植物药材。刘蓬勃计分析,中红外光谱既可进行中药材定性鉴别又可以进行常 等使用傅里叶变换拉曼光谱成功鉴别了八角茴香及其伪量成分定量分析,样本数量可多可少,样本成分差异可大 品莽草和红茴香 小。中药材中红外光谱鉴定技术的未来方向是:建立大样本 2.1.3X射线衍射图谱鉴定技术X射线衍射图谱为X射量的光谱数据库,建立各类和各种中药材的中红外光谱快速 线受到原子核外电子的散射而发生的衍射,而不同原子排列鉴定平台;研究建立企业、行业和国家标准等多级鉴定标准 的晶体会产生特定的衍射图像(图谱),一般用于推测晶体结将中药材性状鉴别与红外光谱分析相结合,找出中药材性状 构。中药材的X衍射图谱应为其所含各种成分中所有原子特征与红外光谱特征的关系,对中药材进行更全面的鉴别 的衍射图谱叠加后构成的特征图谱。由衍射图形及衍射峰2.2色谱鉴定技术 值构成,具有指纹性,可用于中药材的鉴定。中药材衍射图 色谱技术是中药化学成分分离分析及中药质量评价和 谱由弥散峰(所含的大量淀粉,多糖,纤维,蛋白等大分子控制的核心技术,其中薄层色谱最早应用于中药的理化 成分产生)和晶体物质锐峰(如草酸钙、蔗糖等个别晶态物定,目前HPLC为代表的高效色谱技术逐渐成为中药鉴定主 质)两类峰叠加而成 要技术,其他还有气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳 X射线衍射首次于1997年运用于中药材的鉴定,其(HPCE)等 后进行了植物、动物和矿物多种药材的鉴定研究。比较而 高效色谱鉴定技术应用于中药材鉴定源于“指纹图谱” 言,鉴定效果较好的是矿物类中药,如含钙类矿物药的鉴概念,也即色谱技术对中药所含化合物进行分离和检测,得 定、珍珠粉和贝壳粉的鉴定圓等;植物药次之,如中药蛇到表征各类成分的系列色谱峰,通过色谱峰的数目、峰位和 床子等;全动物体类药的特征性稍差 峰高度的特异性构建特定化学指纹图谱,该指纹图谱反映出 2.1.4其他光谱鉴定技术紫外可见吸收光谱是一种常研究对象的精细化学构成特征,可用于中药的鉴定。理论上 见的光谱分析方法。使用紫外光谱对中药材进行测试时,需不同物种具有不同的化学色谱指纹,但生物的代谢产物受环 要先用一定的溶剂对药材进行提取。中药材成分复杂,单一境、生长发育阶段、不同生物部位等因素的影响较大,同时色 溶剂提取物很难反映药材的整体化学成分,也不易鉴别不同谱技术本身的分离和侦测能力和限制,以及样品前处理的影 物种的药材。因此,袁久荣国提出了“中药鉴别紫外光谱谱响,导致有时同一物种的药材指纹图谱差别较大。因此,指 线组法”:分别使用石油醚、氯仿、乙醇和水4种极性不同的纹图谱用于中药鉴定时需大样本总结物种的共性特征,不同 溶剂对中药材进行提取,将这4种溶剂提取物的紫外光谱作的中药材品种鉴定标准会有一定的差异 为该药材的鉴别特征。然而药材提取物的紫外光谱往往存2.2.1HPLC鉴定技术HPC以液体为流动相,采用高压 在吸收峰较宽、重叠严重等问题,袁久荣等进一步提出了输液系统,将不同极性流动相泵入装有固定相的色谱柱,在 “中药鉴别导数紫外光谱谱线组法”,通过导数光谱可增强谱柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测。利用梯度洗脱 图特征性 技术可将药材中的各类成分分离结果表征在一张色谱图上。 紫外灯照射下的荧光性质也可鉴别不同物种的药不同的色谱柱(固定相)、流动相和色谱系统对化合物的分离 o1994-2013CHinaAcademicJournalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
黄与伪品华北大黄。此外，红外光谱三级鉴别法还成功用于 人参［61］、阿胶［62］、淫羊藿［63］等多种中药材的鉴定。 2. 1. 2 近红外和拉曼光谱鉴定技术 近红外光谱法也可用 于中药材鉴别。由于存在谱图影响因素多、背景复杂、谱峰 重叠等限制，近红外光谱的谱图差异不仅源于化学成分的不 同，也可能源于粒度、密度等物理因素的变化。因此，样本间 化学差异较小时，近红外光谱主要用于物理性质一致的大量 样本的统计分析，例如不同产地相同物种药材的识别以及药 材中常量成分的定量分析，而在不同物种中药材鉴定方面应 用较少。刘浩等［64］使用二维相关近红外光谱鉴别了香加皮 和五加皮，沈海龙等［65］利用近红外漫反射光谱法鉴别了地 骨皮和伪品荃皮、大青根皮。 拉曼光谱也是一种分子振动光谱，可以用于中药材的鉴 定，所提供的信息与中红外光谱具有互补性。若中药材含有 可产生荧光的成分，可能导致无法观察到药材的拉曼信号， 因此需要使用波长较长的激发光源( 如波长为 1 064 nm 的 Nd: YAG 激光) 。孙素琴等［66］首次使用傅里叶变换拉曼光谱 仪直接测定了党参、茯苓、山药等 23 种植物药材。刘蓬勃 等［67］使用傅里叶变换拉曼光谱成功鉴别了八角茴香及其伪 品莽草和红茴香。 2. 1. 3 X-射线衍射图谱鉴定技术 X-射线衍射图谱为X-射 线受到原子核外电子的散射而发生的衍射，而不同原子排列 的晶体会产生特定的衍射图像( 图谱) ，一般用于推测晶体结 构。中药材的 X-衍射图谱应为其所含各种成分中所有原子 的衍射图谱叠加后构成的特征图谱。由衍射图形及衍射峰 值构成，具有指纹性，可用于中药材的鉴定。中药材衍射图 谱由弥散峰( 所含的大量淀粉，多糖，纤维，蛋白等大分子 成分产生) 和晶体物质锐峰( 如草酸钙、蔗糖等个别晶态物 质) 两类峰叠加而成。 X-射线衍射首次于 1997 年运用于中药材的鉴定［68］，其 后进行了植物、动物和矿物多种药材的鉴定研究。比较而 言，鉴定效果较好的是矿物类中药，如含钙类矿物药的鉴 定［69］、珍珠粉和贝壳粉的鉴定［70］等; 植物药次之，如中药蛇 床子［71］等; 全动物体类药的特征性稍差［72］。 2. 1. 4 其他光谱鉴定技术 紫外-可见吸收光谱是一种常 见的光谱分析方法。使用紫外光谱对中药材进行测试时，需 要先用一定的溶剂对药材进行提取。中药材成分复杂，单一 溶剂提取物很难反映药材的整体化学成分，也不易鉴别不同 物种的药材。因此，袁久荣［73］提出了“中药鉴别紫外光谱谱 线组法”: 分别使用石油醚、氯仿、乙醇和水 4 种极性不同的 溶剂对中药材进行提取，将这 4 种溶剂提取物的紫外光谱作 为该药材的鉴别特征。然而药材提取物的紫外光谱往往存 在吸收峰较宽、重叠严重等问题，袁久荣等［74］进一步提出了 “中药鉴别导数紫外光谱谱线组法”，通过导数光谱可增强谱 图特征性。 紫外灯 照 射 下 的 荧光性质也可鉴别不同物种的药 材［75］，但该方法主观性强、特征性差。采用三维荧光光谱可 提供药材成分的更多信息，便于寻找不同物种药材的差异。 魏永巨等［76-77］使用三维荧光光谱分别鉴别了白花前胡与紫 花前胡、山豆根与北豆根。 核磁共振谱、太赫兹光谱等其他光谱和波谱方法也用于 中药材的鉴别研究。秦海林等［78-79］使用核磁共振氢谱对天 麻、黄连等药材进行了鉴别。陈艳江等［80］ 使用太赫兹光谱 和支持向量机方法对炙甘草和生甘草、南柴胡和北柴胡、山 豆根和北豆根进行了鉴别。但是受到仪器成本等方面的限 制，这些方法的推广普及有一定的难度。 2. 1. 5 光谱鉴定技术的发展方向 紫外光谱、荧光光谱和 核磁共振谱的测试常需对药材进行提取分离处理，而红外光 谱和拉曼光谱可直接测试药材，拉曼光谱和近红外光谱对未 经预处理的样品不需与仪器本身接触也可测试，还可通过光 纤等方式进行原位在线检测。因受到荧光背景的干扰，很多 中药材的拉曼光谱特征性较差，使其应用到中药材鉴定受 限。近红外光谱技术适宜于物化性质近似的大量样本的统 计分析，中红外光谱既可进行中药材定性鉴别又可以进行常 量成分定量分析，样本数量可多可少，样本成分差异可大可 小。中药材中红外光谱鉴定技术的未来方向是: 建立大样本 量的光谱数据库，建立各类和各种中药材的中红外光谱快速 鉴定平台; 研究建立企业、行业和国家标准等多级鉴定标准; 将中药材性状鉴别与红外光谱分析相结合，找出中药材性状 特征与红外光谱特征的关系，对中药材进行更全面的鉴别。 2. 2 色谱鉴定技术 色谱技术是中药化学成分分离分析及中药质量评价和 控制的核心技术，其中薄层色谱最早应用于中药的理化鉴 定，目前 HPLC 为代表的高效色谱技术逐渐成为中药鉴定主 要技术，其 他 还 有 气 相 色 谱 法 ( GC) 和高效毛细管电泳 ( HPCE) 等。 高效色谱鉴定技术应用于中药材鉴定源于“指纹图谱” 概念，也即色谱技术对中药所含化合物进行分离和检测，得 到表征各类成分的系列色谱峰，通过色谱峰的数目、峰位和 峰高度的特异性构建特定化学指纹图谱，该指纹图谱反映出 研究对象的精细化学构成特征，可用于中药的鉴定。理论上 不同物种具有不同的化学色谱指纹，但生物的代谢产物受环 境、生长发育阶段、不同生物部位等因素的影响较大，同时色 谱技术本身的分离和侦测能力和限制，以及样品前处理的影 响，导致有时同一物种的药材指纹图谱差别较大。因此，指 纹图谱用于中药鉴定时需大样本总结物种的共性特征，不同 的中药材品种鉴定标准会有一定的差异。 2. 2. 1 HPLC 鉴定技术 HPLC 以液体为流动相，采用高压 输液系统，将不同极性流动相泵入装有固定相的色谱柱，在 柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测。利用梯度洗脱 技术可将药材中的各类成分分离结果表征在一张色谱图上。 不同的色谱柱( 固定相) 、流动相和色谱系统对化合物的分离 ·1046· 第 37 卷第 8 期 2012 年 4 月 Vol. 37，Issue 8 April，2012
第37卷第8期 中国中药杂志 Issue 8 2012年4月 程度产生一定的影响,获得的色谱指纹具有某些差异;不同 HPCE适用于中药的水溶性成分以及蛋白等大分子成 检测器和检测参数也产生不同的指纹图谱。 分,也可以成为HPLC指纹的有效补充,但HPCE方法的重复 HPLC色谱鉴定技术用于中药材鉴定的优点是具有高效性较色谱差 的分离能力可精细和准确地表征中药材小分子化学成分的HPCE己在中药鉴定中的应用如侯连兵等圆对三七及其 数和量特征。利用不同溶剂不同提取分离分析方法不但能混淆品菊叶三七的蛋白多肽进行了HPCE法的鉴别,在酸性、 消除复杂背景的干扰,而且可将微量成分富集并进行表征。碱性和中性提取液中三七及其混淆品都存在明显差异。孙毓 利用不同的色谱柱和流动相及不同的检测系统,可以获得中庆等研究了冬虫夏草与蛹虫草、人工蛹虫草、亚香棒草的 药材中多种多类化学特征指纹。表征有效成分或活性成分以HPCE指纹图谱,发现它们存在明显区别,可鉴别伪品及次 HPLC色谱特征可与中药材的功效建立关系 品。曾艳萍等研究了常用中草药沙苑子的HPCE指纹图 缺点是色谱指纹在种内的多变性,色谱指纹图谱提供的谱,发现正品沙苑子相似度良好,但与草沙苑的指纹图谱在峰 化学信息比较精细,不同中药材的鉴定特征提取和鉴定标准数目、峰位、积分值等特征上有显著差异 建立需要较大的样本量;每种中药的鉴定包括了特定的固定 外UPLC采用1.7pm颗粒度的色谱柱填料,与HPLC 相、流动相和检测方法的特定组合,鉴定方法上通用性较差:相比,提高了柱效、流速、分析时间、峰容量和灵敏度。叶文 色谱指纹图谱随色谱柱的品牌型号、色谱仪器等影响稍有文等圆建立了白术的UPLC指纹图谱,在22min内标记了 变化。 32个峰,样品成分整体分离度良好,建立的共有指纹图谱模 HPLC指纹图谱用于中药材和中药饮片的鉴定取得了可式可有效鉴别白术的真伪。 喜的成绩。翟为民等用HPLC指纹图谱鉴别了人参、西洋2.3色谱光谱联用鉴定技术 参和三七。陈胡兰等对市场上38批地丁类药材的鉴别 色谱光谱联用鉴定技术是具高效分离性能的色谱技术 研究,表明紫花地丁与其混淆品苦地丁的HPLC指纹图谱差与能获取化学成分丰富结构信息的光谱技术相结合形成的 异大,易区别。张尊建等圓证实密花石斛、马鞭石斛、短棒系列中药鉴定技术。主要有高效液相色谱质谱(HPLC 石斛、鼓槌石斛和金钗石斛的HPCUⅤ指纹图谱有显著的MS)、气相色谱质谱(GC-MS)、红外光谱顽谱(IRMS)、质 差异。裴利宽等圓研究了淫羊藿物种的黄酮类HPLC指纹谱质谱(MSMs)、气相色谱付里叶变换红外光谱(GC+T- 图谱,表明朝鲜淫羊藿、心叶淫羊藿、粗毛淫羊藿、巫山淫羊I)、高效毛细管电泳质谱( HPCE-MS)等。其中应用最广泛 藿的大部分样品具有可资鉴别的HPLC指纹图谱特征,可用的是 HPLC-MS 于淫羊藿药材的鉴别 2.3.1 HPLC-MS鉴定技术 HPLC-MS联用技术,利用质谱 2.2.2CC鉴定技术GC主要是根据不同化合物在固定相进行成分的检测和解析,提高了传统检测器灵敏度和选择 和气体流动相之间的分配不同进行分离分析的手段,适用于性,可对中药样本中未知化学成分进行定性、初步确定未知 气体、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸气压固体化学成分的化学结构 的分析国。程序升温分析方法可以获得更为详尽的成分信 HPLC-MS与HPLC相比具有适合检测分离后容易发生 息,用于鉴定的GC指纹图大多是通过程序升温方法获得。变化和损坏的样品或者不易分离的样品;检测灵敏度提高 GC指纹鉴定是针对中药中可挥发性且热稳定性的药材分析色谱峰所代表的化学成分结构信息,使得鉴定信息具体 化学成分,因此是HPLC指纹的有效补充 和准确等优点 GC从20世纪80年代初就用于中药品种鉴别。如金海 孙萍等应用LCMS对木通、川木通和关木通化学成 燕等圆建立了羌活、独活的GC指纹图谱,研究发现羌活、独分的分析,表明木通与川木通含有较多相似成分,3种药材的 活GC指纹图谱存在显著差异,只需计算未知供试品与所建MS基峰离子存在显著差异,据此可鉴别3种木通。 Min ye 立共有模式间的相似度即可鉴别两者。张广春等通过西等对2种菟丝子进行了LCMS分析,鉴定出50个成分 红花及其伪品的GC色谱行为分析,发现所有西红花都含有南方菟丝子主要含山柰酚及紫云英苷,而菟丝子主要含金丝 3个特征峰群,而伪品均不含有该3个特征峰群,藉以快速鉴桃苷,其他酚性成分亦存在显著差异;根据化学成分差异可 别真品与伪品。 以鉴别菟丝子的不同品种。胡岩等圆采用该法获得了八角 2.2.3HPCE鉴定技术HPCE是以高压电场为驱动力,以科17个种22个果皮样品的倍半萜内酯特征成分的总离子 毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为流图和质谱图,能够很好地表征八角科植物果皮中倍半萜内 上的差异而实现分离分析的液相分析方法。HPCE易于选择酯成分的特点,色谱图特征可有效鉴别原药材或药材粉末。 各种分离性的添加剂,具有分析效率高、扩散系数小和样品2.3.2其他色谱光谱联用技术GCMS是目前分析和鉴 量小等优点国,可分离蛋白质、多肽等大分子成分,也可以别具有挥发性、半挥发性成分中药的首选技术。如 Ruijing 分离小分子成分,特别适合有机酸、生物碱等带电荷物Pan等例采用GCMS结合指纹图谱以及化学计量学方法分 别鉴定了半枝莲、耳草与半边莲中的50,36,38个成分,利用 o1994-2013CHinaAcademicJournalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
程度产生一定的影响，获得的色谱指纹具有某些差异; 不同 的检测器和检测参数也产生不同的指纹图谱。 HPLC 色谱鉴定技术用于中药材鉴定的优点是具有高效 的分离能力，可精细和准确地表征中药材小分子化学成分的 数和量特征。利用不同溶剂不同提取分离分析方法不但能 消除复杂背景的干扰，而且可将微量成分富集并进行表征。 利用不同的色谱柱和流动相及不同的检测系统，可以获得中 药材中多种多类化学特征指纹。表征有效成分或活性成分 HPLC 色谱特征可与中药材的功效建立关系。 缺点是色谱指纹在种内的多变性，色谱指纹图谱提供的 化学信息比较精细，不同中药材的鉴定特征提取和鉴定标准 建立需要较大的样本量; 每种中药的鉴定包括了特定的固定 相、流动相和检测方法的特定组合，鉴定方法上通用性较差; 色谱指纹图谱随色谱柱的品牌型号、色谱仪器等影响稍有 变化。 HPLC 指纹图谱用于中药材和中药饮片的鉴定取得了可 喜的成绩。翟为民等［81］用 HPLC 指纹图谱鉴别了人参、西洋 参和三七。陈胡兰等［82］ 对市场上 38 批地丁类药材的鉴别 研究，表明紫花地丁与其混淆品苦地丁的 HPLC 指纹图谱差 异大，易区别。张尊建等［83］证实密花石斛、马鞭石斛、短棒 石斛、鼓槌石斛和金钗石斛的 HPLC-UV 指纹图谱有显著的 差异。裴利宽等［84］研究了淫羊藿物种的黄酮类 HPLC 指纹 图谱，表明朝鲜淫羊藿、心叶淫羊藿、粗毛淫羊藿、巫山淫羊 藿的大部分样品具有可资鉴别的 HPLC 指纹图谱特征，可用 于淫羊藿药材的鉴别。 2. 2. 2 GC 鉴定技术 GC 主要是根据不同化合物在固定相 和气体流动相之间的分配不同进行分离分析的手段，适用于 气体、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸气压固体 的分析［85］。程序升温分析方法可以获得更为详尽的成分信 息，用于鉴定的 GC 指纹图大多是通过程序升温方法获得。 GC 指纹鉴定是针对中药中可挥发性且热稳定性的药材 化学成分，因此是 HPLC 指纹的有效补充。 GC 从 20 世纪 80 年代初就用于中药品种鉴别。如金海 燕等［86］建立了羌活、独活的 GC 指纹图谱，研究发现羌活、独 活 GC 指纹图谱存在显著差异，只需计算未知供试品与所建 立共有模式间的相似度即可鉴别两者。张广春等［87］通过西 红花及其伪品的 GC 色谱行为分析，发现所有西红花都含有 3 个特征峰群，而伪品均不含有该 3 个特征峰群，藉以快速鉴 别真品与伪品。 2. 2. 3 HPCE 鉴定技术 HPCE 是以高压电场为驱动力，以 毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为 上的差异而实现分离分析的液相分析方法。HPCE 易于选择 各种分离性的添加剂，具有分析效率高、扩散系数小和样品 量小等优点［88］，可分离蛋白质、多肽等大分子成分，也可以 分离 小 分 子 成 分，特别适合有机酸、生物碱等带电荷 物 质［89］。 HPCE 适用于中药的水溶性成分以及蛋白等大分子成 分，也可以成为 HPLC 指纹的有效补充，但 HPCE 方法的重复 性较色谱差。 HPCE 已在中药鉴定中的应用如侯连兵等［90］对三七及其 混淆品菊叶三七的蛋白多肽进行了 HPCE 法的鉴别，在酸性、 碱性和中性提取液中三七及其混淆品都存在明显差异。孙毓 庆等［91］研究了冬虫夏草与蛹虫草、人工蛹虫草、亚香棒草的 以 HPCE 指纹图谱，发现它们存在明显区别，可鉴别伪品及次 品。曾艳萍等［92］研究了常用中草药沙苑子的 HPCE 指纹图 谱，发现正品沙苑子相似度良好，但与草沙苑的指纹图谱在峰 数目、峰位、积分值等特征上有显著差异。 此外 UPLC 采用 1. 7 μm 颗粒度的色谱柱填料，与 HPLC 相比，提高了柱效、流速、分析时间、峰容量和灵敏度。叶文 文等［93］建立了白术的 UPLC 指纹图谱，在 22 min 内标记了 32 个峰，样品成分整体分离度良好，建立的共有指纹图谱模 式可有效鉴别白术的真伪。 2. 3 色谱-光谱联用鉴定技术 色谱-光谱联用鉴定技术是具高效分离性能的色谱技术 与能获取化学成分丰富结构信息的光谱技术相结合形成的 系列中药鉴定技术［94］。主要有高效液相色谱-质谱( HPLCMS) 、气相色谱-质谱( GC-MS) 、红外光谱-质谱( IR-MS) 、质 谱-质谱( MS-MS) 、气相色谱-付里叶变换红外光谱( GC-FTIR) 、高效毛细管电泳-质谱( HPCE-MS) 等。其中应用最广泛 的是 HPLC-MS。 2. 3. 1 HPLC-MS 鉴定技术 HPLC-MS 联用技术，利用质谱 进行成分的检测和解析，提高了传统检测器灵敏度和选择 性，可对中药样本中未知化学成分进行定性、初步确定未知 化学成分的化学结构［95］。 HPLC-MS 与 HPLC 相比具有适合检测分离后容易发生 变化和损坏的样品或者不易分离的样品; 检测灵敏度提高; 分析色谱峰所代表的化学成分结构信息，使得鉴定信息具体 和准确等优点。 孙萍等［96］应用 LC-MS 对木通、川木通和关木通化学成 分的分析，表明木通与川木通含有较多相似成分，3 种药材的 MS 基峰离子存在显著差异，据此可鉴别 3 种木通。Min Ye 等［97］对 2 种菟丝子进行了 LC-MS 分析，鉴定出 50 个成分， 南方菟丝子主要含山柰酚及紫云英苷，而菟丝子主要含金丝 桃苷，其他酚性成分亦存在显著差异; 根据化学成分差异可 以鉴别菟丝子的不同品种。胡岩等［98］采用该法获得了八角 科 17 个种 22 个果皮样品的倍半萜内酯特征成分的总离子 流图和质谱图，能够很好地表征八角科植物果皮中倍半萜内 酯成分的特点，色谱图特征可有效鉴别原药材或药材粉末。 2. 3. 2 其他色谱-光谱联用技术 GC-MS 是目前分析和鉴 别具有挥发性、半挥发性成分中药的首选技术。如 Ruijing Pan 等［99］采用 GC-MS 结合指纹图谱以及化学计量学方法分 别鉴定了半枝莲、耳草与半边莲中的 50，36，38 个成分，利用 ·1047· 第 37 卷第 8 期 2012 年 4 月 Vol. 37，Issue 8 April，2012