氯仿:对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都 有刺激作用,它是致癌剂并可损 伤肝脏和肾脏,操作时需戴手套、 安全镜并在通风橱中进行。 苯酚:是强腐蚀剂,能引起严重烧伤。 操作时应戴手套、安全镜、穿防 护服,并在通风橱中进行
氯仿: 对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都 有刺激作用，它是致癌剂并可损 伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、 安全镜并在通风橱中进行。 苯酚:是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。 操作时应戴手套、安全镜、穿防 护服，并在通风橱中进行
感受态细胞的制备 将外源DNA导入大肠杆菌去主要有两种方法: 1.电转化法:利用瞬间高压在细胞上打孔。因而需用 冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞, 以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。109 10转化子gDNA; 2.CaCl2法:利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细 胞,可以诱导其产生短暂的“感受态”,易于摄取 外源DNA。106-107DNA
感受态细胞的制备 将外源DNA导入大肠杆菌去主要有两种方法： 1. 电转化法：利用瞬间高压在细胞上打孔。因而需用 冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞， 以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。109 －1010转化子/g DNA； 2. CaCl2 法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细 胞，可以诱导其产生短暂的“感受态” ，易于摄取 外源DNA。106－107 /g DNA
实际操作过程中应注意的事项: 1.密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数 生长期的细胞(一般通过检测OD60来控制 DH5a菌株OD6为0.5时细胞密度是5×107/m) 2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行; 3.所使用的器皿必须干净。因为痕量的去污剂或其 它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率 另外,转化时还应注意质粒的质量和浓度:(1)用 于转化的应主要是超螺旋的DNA;(2)一定范围 内,转化效率与外源DNA的浓度呈正比)
实际操作过程中应注意的事项： 1. 密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数 生长期的细胞 （一般通过检测OD600来控制。 DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107 /ml）； 2. 所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3. 所使用的器皿必须干净。因为痕量的去污剂或其 它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率 另外，转化时还应注意质粒的质量和浓度： （1）用 于转化的应主要是超螺旋的DNA；（2）一定范围 内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比)
操作步骤(一): 1.前夜接种受体菌(DH5α或DH10B),挑取单菌落 于LB培养基中37C培养过夜(约16小时) 2.转接1m过夜培养物于100m添加有20 mM MgC2在 37C摇床剧烈振荡培养约25-3小时(300rpm); 3.将0 IM Cacl2溶液置于冰上预冷;(注:后继步骤 需在无菌和0-4C下操作) 4.吸取1.5ml培养好的菌液至15m离心管中,在冰上 冷却10分钟;
操作步骤（一）： 1. 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落 于LB 培养基中37ºC 培养过夜（约16小时）； 2. 转接1ml过夜培养物于100ml 添加有20mM MgCl2 在 37ºC摇床剧烈振荡培养约2.5-3 小时（300rpm）； 3. 将0.1M CaCl2 溶液置于冰上预冷；( 注：后继步骤 需在无菌和0-4ºC下操作) 4. 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上 冷却10分钟；
操作步骤(二) 5.4C下4000pm冷冻离心10分钟; 6.弃去上清,加入100预冷0. M Caci2溶液,用 移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮, 在冰上放置20分钟; 7.重复6、7、6步骤 8.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保 护剂后超低温冷冻贮存备用(-70C)
操作步骤（二） 5. 4ºC下4000rpm冷冻离心10分钟； 6. 弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用 移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮， 在冰上放置20分钟； 7. 重复6、7、6步骤； 8. 细胞悬浮液可立即用于转化实验 或添加冷冻保 护剂后超低温冷冻贮存备用（－70ºC）