利用质粒载体克隆水稻DNA片段
利用质粒载体克隆水稻DNA片段
外源DNA 克隆的要求 说明 所带的末端 非重组克隆的背景高 平端 要求较高的DNA及连接酶2.不同酶切的平头可连接 3.质粒及外源DNA连接处 的酶切位点消失 4.重组质粒会带有外源 DNA的串联拷贝 酶切位点可保留 不同的突出端用两种限制酶消化后 2.非重组克隆背景低 需纯化质粒以提高连接效率3.不需CIP处理 4.外源DNA只以一个方 向插入重组质粒中 相同的突出端线状质粒DNA常需用磷1.酶切位点常可保留 外源DNA会以两个方向 酸酶(CIP)处理 插入 3.重组质粒可带有外源 DNA的串联拷贝
外源DNA 克隆的要求 说明 所带的末端 平端 要求较高的DNA及连接酶 不同的突出端 用两种限制酶消化后 需纯化质粒以提高连接效率 相同的突出端 1. 酶切位点可保留 2. 非重组克隆背景低 3. 不需CIP处理 4. 外源DNA只以一个方 向插入重组质粒中 1. 非重组克隆的背景高 2. 不同酶切的平头可连接 3. 质粒及外源DNA连接处 的酶切位点消失 4. 重组质粒会带有外源 DNA的串联拷贝 线状质粒DNA常需用磷 酸酶（CIP）处理 1. 酶切位点常可保留 2. 外源DNA会以两个方向 插入 3. 重 组 质 粒 可 带 有 外 源 DNA的串联拷贝
多克隆位点 外源DNA 限制性內切酶酶切 限制性内切酶酶切 3-0H 30H 5°P 30H CIAP去除5磷酸 T4连接酶连接 转化E.Coli
CIAP去除5‘磷酸 外源DNA 限制性内切酶酶切 5‘P 3‘OH 5’P 3‘OH 5’P 5’P 3‘OH 3‘OH T4连接酶连接 5’OH 5’OH 3’OH 转化E.Coli 限制性内切酶酶切 多克隆位点
蓝色菌落:载体自连 白色菌落:外源片段插入
蓝色菌落：载体自连 白色菌落：外源片段插入
在质粒中克隆外源片段的主要步骤(-): 1.载体及外源片段的限制酶消化:限制性内切酶 切出相互匹配的粘性末端(一种酶)或不相匹 配的粘性末端(不同酶消化)或平端; 2.载体的去磷酸化:碱性磷酸酶去除载体的5’-P 基团,以防载体自连; 3.线状载体与外源片段的连接:连接酶使双链 DNA5”-P与相邻的3-OH之间形成新的共价 键,若质粒载体的两条链都带有5磷酸基团, 则可形成4个新的磷酸二酯键,但如质粒已去 磷酸化,则只能形成2个新的磷酸二酯键,且 产生的两个杂交分子带有2个单链切口,当杂 合体导入到感受态细胞后可被修复
在质粒中克隆外源片段的主要步骤（一）： 1. 载体及外源片段的限制酶消化: 限制性内切酶 切出相互匹配的粘性末端〔一种酶〕或不相匹 配的粘性末端（不同酶消化）或平端； 2. 载体的去磷酸化: 碱性磷酸酶去除载体的5’－P 基团，以防载体自连； 3. 线状载体与外源片段的连接: 连接酶使双链 DNA 5’－P与相邻的3’－OH之间形成新的共价 键，若质粒载体的两条链都带有5‘磷酸基团， 则可形成4个新的磷酸二酯键，但如质粒已去 磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，且 产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂 合体导入到感受态细胞后可被修复