碱裂解法: solution i重悬细菌后,加入 solution i,其 中的SDS破坏细胞壁、膜,使细胞内容物释放出 来,NaOH使DNA变性、碱基对打开,使宿主染 色体DNA双链分开,而闭合环状的质粒DNA处 于拓扑缠绕状态,两个环并不分开,当加入 SolutionⅢ中和后,宿主DNA由于很大,碱基 还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白 质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来, 而质粒DNA由于很小且双链未分开,能够迅速 配对重新形成超螺旋,处于溶解状态
质粒的沉淀:加2/3体积的异丙醇,室温 下放置5分钟或两倍体积95% 乙醇混匀,冰上放置10分钟 质粒的纯化:一般采用苯酚氯仿纯化质 粒;为满足较高要求,可采用 氯化铯密度梯度离心
质粒的沉淀：加2/3体积的异丙醇，室温 下放置5分钟或两倍体积95％ 乙醇混匀，冰上放置10分钟； 质粒的纯化：一般采用苯酚/氯仿纯化质 粒; 为满足较高要求，可采用 氯化铯密度梯度离心
操作步骤(一): 接种于含有相应抗生素的LB培养基(含 AMP),过夜培养; 2.吸取15m菌液,12000rpm离心2分钟; 3.加入100μ I solutionⅠ振荡打匀,重新悬浮细胞; (注意:应彻底打匀使无沉淀或碎块 4.加入200μ I solutionⅡ轻柔颠倒混匀,放置冰上 至清亮,一般不超过5分钟; 5.加入150μ I solutionⅢ颠倒混匀,放置于冰上10 分钟,使杂质充分沉淀;
操作步骤（一）： 1. 接 种 于 含 有 相 应 抗 生 素 的 LB 培 养 基 （ 含 AMP），过夜培养； 2. 吸取1.5ml菌液，12000rpm离心2分钟； 3. 加入100l solution Ⅰ振荡打匀，重新悬浮细胞； （注意：应彻底打匀使无沉淀或碎块） 4. 加入200l solution Ⅱ轻柔颠倒混匀，放置冰上 至清亮，一般不超过5分钟； 5. 加入150l solution Ⅲ颠倒混匀，放置于冰上10 分钟，使杂质充分沉淀；
操作步骤(二) 6.1200rpm离心10分钟; 7.吸取400u上清(注意:不要汲取到飘浮的杂 质),加2/3体积的异丙醇,室温下放置5分钟 或两倍体积95%乙醇混匀,冰上放置10分钟; 8.12000rpm4C冷冻离心15分钟; 9.倒尽上清,加75%乙醇浸洗洗盐,(放置片刻 后倒去上清;或离心5分钟) 10.加50μ灭菌超纯水或TE溶解
操作步骤（二） 6. 12000rpm离心10分钟； 7. 吸取400l上清（注意：不要汲取到飘浮的杂 质），加2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟 或两倍体积95％乙醇混匀，冰上放置10分钟； 8. 12000rpm4ºC冷冻离心15分钟； 9. 倒尽上清，加75％乙醇浸洗洗盐，（放置片刻 后倒去上清；或离心5分钟） 10.加50 l灭菌超纯水或TE溶解
质粒DNA质量检测 1.DNA纯度:吸光值检测:检测260mm、280mm 吸光值,紫外分光光度计A260/A280=1.8-2.0; 18最佳,低于18说明有蛋白质,大于18说明有 RNA。 2.质量检测:琼脂糖凝胶电泳:一般有三条带 (超螺旋、开环、线型三种构型),点样孔附 近无DNA带(无染色体DNA污染)。 3.DNA浓度 10D=50ug/mlDS-DNA或 1 OD=40ug/mI rNA or ss-dNa
质粒DNA质量检测 1. DNA纯度：吸光值检测：检测260nm、280nm 吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.8－2.0； 1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有 RNA。 2. 质量检测：琼脂糖凝胶电泳：一般有三条带 （超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附 近无DNA带（无染色体DNA污染）。 3. DNA浓度： 1 0D＝50ug/ml DS-DNA 或 1 0D＝ 40ug/ml RNA or SS－DNA