一、PCR技术的诞生 口PCR的改进与完善 ·Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow.片段。 DNA-polI DNA-pol II DNA-pol III N端 DNA pol I 木瓜蛋白酶 5'-3'聚合 +DNA pol I: 去除引物 3'-5外切 +i 校正复制错误，填补 小片段 大片段/Klenow片段 5'→3核酸外切酶活性 5→3'聚合酶活性 3'→5核酸外切酶活性 5'-3外切 复制和修复中的空隙 聚合速度 Klenow片段是基因工程 (nt/s) 16-20 40 250-1,000 中常用的工具酶，可用 延长能力 (nt) 3-200 1,500 ≥500,000 于实验室合成DNA
16 PCR的改进与完善 • Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。 一、PCR技术的诞生 DNA pol I：去除引物， 校正复制错误，填补 复制和修复中的空隙。 Klenow片段是基因工程 中常用的工具酶，可用 于实验室合成DNA
PCR技术的诞生 口PCR的改进与完善 ·Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow.片段。 不耐 90℃会变性失活，每 高温 次循环都需要重新添加 Klenow酶 的缺点 37℃下进行链延伸容 特异 易发生模板和引物之间 性差 的碱基错配，合成的 DNA片段不均一
17 PCR的改进与完善 • Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。 一、PCR技术的诞生
一、PCR技术的诞生 口PCR的改进与完善 ·1988年美国Cetus公司的Saiki等从生长在温 泉中的嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取 到一种耐热DNA聚合酶，命名为Taq DNA聚 合酶。 70℃，2h,酶活性>90%； 耐高温 90℃，2h,酶活性~50%； Taq DNA:聚合酶 不必每次反应后再加新酶. 化 的优点 特异 提高扩增效率， 性好 扩增长度达到2kb:
18 PCR的改进与完善 • 1988年美国Cetus公司的Saiki等从生长在温 泉中的嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取 到一种耐热DNA聚合酶，命名为Taq DNA聚 合酶。 一、PCR技术的诞生
PCR仪 BIO RAD 000 商时 0 陋回图 888
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二、PCR技术的基本原理 1.PCR的基本原理 ·类似于DNA的体内复制过程，即以待扩增 的DNA分子为模板、以一对分别与模板 DNA两条链互补的寡聚脱氧核苷酸为引物 以四种dNTP为底物、由DNA聚合酶按照半 保留复制的机制沿着模板链延伸而合成新 的DNA,不断重复这一过程，即可使目的 DNA得到扩增
20 1. PCR的基本原理 • 类似于DNA的体内复制过程，即以待扩增 的DNA分子为模板、以一对分别与模板 DNA两条链互补的寡聚脱氧核苷酸为引物、 以四种dNTP为底物、由DNA聚合酶按照半 保留复制的机制沿着模板链延伸而合成新 的DNA，不断重复这一过程，即可使目的 DNA得到扩增。 二、PCR技术的基本原理