第五章 分子生物学基本研究法 1
1 第五章 分子生物学基本研究法
分子生物学基本研究法 ·5.1基因操作与功能研究 ·5.2蛋白质操作与功能研究 2
2 分子生物学基本研究法 • 5.1 基因操作与功能研究 • 5.2 蛋白质操作与功能研究
5.1基因操作与功能研究 5.1.1基因克隆技术 ·在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆(clone)表 示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群 体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins)便是属于同一克隆。 ·在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞(progenitor cell)分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 ·在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的 载体DA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 3
3 5.1.1 基因克隆技术 • 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表 示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群 体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。 • 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 • 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的 载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 5.1 基因操作与功能研究
l.RACE技术rapid amplification of cDNA ends ·是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知 序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR 扩增得到目的序列。用于扩增5端的方法称为5RACE,用 于扩增3端的称为3RACE。 . 已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法 显示和基因文库筛选。 4
4 1. RACE技术 rapid amplification of cDNA ends • 是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知 序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR 扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用 于扩增3’端的称为3’RACE。 • 已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法 显示和基因文库筛选
mRNA 1.RACE技术 5 ·5RACE ↓ 5 在反转录酶的作用下，以已知基因 片段内部。特异性引物启始cDNA 第一条链的合成 15 。 RNase混合物降解模板mRNA,纯 化cDNA第一条链。 3CC.CC 用末端转移酶在cDNA链3端加入 Abridged Anchor Primer 连续的dCTP 5☐G1+1G◆ 3'CCCC UAP GSP2 以连有oligo(dG)的锚定引物和基 因片段内部特异的nested引物进行 AUAP 5☐G1+1G PCR扩增，以期得到目的片段，并 3☐CCCC 可用nest PCR进行检测。 )·,简画 nested GSP
5 1 . RACE技术 • 5 ’RACE • 在反转录酶的作用下 ，以已知基因 片段内部 。特异性引物启始cDNA 第一条链的合成 • RNase混合物降解模板mRNA ， 纯 化cDNA第一条链 。 • 用末端转移酶在cDNA 链 3 ‘端加入 连续的dCTP • 以连有oligo(dG) 的锚定引物和基 因片段内部特异的nested引物进行 PCR扩增 ，以期得到目的片段 ， 并 可用nest PCR进行检测