CRISPR-Cas9基因编辑
CRISPR-Cas9基因编辑
基因组编辑技术 又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异 性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。 方法包括： •锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)技术 转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术 Cas9/gRNA系统(CRISPR-cas9技术)
又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异 性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。 方法包括： •锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技术 •转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术 •Cas9/gRNA 系统(CRISPR-cas9技术) 基因组编辑技术
锌指核酸酶(ZFN)&转录激活因子 样效应物核酸酶(TALEN): 技术 DNA double-stranded break(DSB) 5 3 3 =5 Nonhomologous Homology-directed end-joining (NHEJ) repair (HDR) 3 Genomic 5 5 =w3 3= 5 Repair S template Premature Indel mutation stop codon Precise gene editing 年31 5' =每■31 量5 3■ 5 Cell2014157,1262-1278 Figure.2A
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B 不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于 DNA序列特异性结合蛋白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切 酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由蛋白特异结合域定位， DNA切割域剪切。 锌指核酸酶（ZFN）＆转录激活因子 样效应物核酸酶（TALEN）技术 Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A
CRISPR-Cas9: 技术 Phage infection Spacer acquisition locus CRISPR crRNA biogenesis and processing Cas Target degradation Cmr complex ▣N Degraded DNA/RNA Ce2014157,1262-1278 Figure4
CRISPR-Cas9 技术 • 原理：规律性重复短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs） • CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一 种适应性免疫防御机制，研究者根据 CRISPR-Cas 系统的特 性对此系统进行改造产生了第 3 代人工核酸内切酶技 术——CRISPR-Cas9技术。该技术通过小片段的 RNA 介导对 入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、 降 解。 • CRISPR-Cas9 技术是一种多物种适应性的，位点特异性的有 效基因组编码工具。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure4
CRISPR-Cas9技术 从已知的序列中通过PAM进行定位寻找合适的靶 位点并合成gRNA 构建gRNA与/Cas9重组质粒。 对重组质粒进行活性检测，敲除活性的计算 挑选活性较高的敲除质粒导入培养的细胞或者生 物体内进行基因组定点编辑操作 利用测序、RFLP等方法检测基因组定点修饰结果
CRISPR-Cas9 技术 从已知的序列中通过 PAM 进行定位寻找合适的靶 位点并合成 gRNA 构建gRNA 与/Cas9 重组质粒。 对重组质粒进行活性检测，敲除活性的计算 挑选活性较高的敲除质粒导入培养的细胞或者生 物体内进行基因组定点编辑操作 利用测序、RFLP 等方法检测基因组定点修饰结果