实验一、基本操作（准备刻度吸管、试管、试管刷、烧杯、洗耳球、洗涤剂及蒸馏水等）实验二、蛋白质的沉淀凝固[原理]蛋白质带有许多正负电荷，在水溶液中呈现两性电解质，又有许多亲水基团，因此其水溶液有一定的稳定性。但经某些方法处理后，破坏其电荷性及亲水性，蛋白质则又很易从溶液中沉淀出来。促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分两类：第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块。[试剂]1.5%蛋白质溶液：取出鸡蛋清用水稀释20倍，即相当5%蛋白质溶液。2.饱和硫酸铵溶液3.硫酸铵结晶粉末4.95%乙醇（AR）5.1%乙酸6.3%硝酸银溶液7.1%硫酸铜一、蛋白质的盐析[原理]用高浓度的中性盐，使蛋白质的荷电性受到破坏并能去掉蛋白质的水化膜，以致失去稳定性而沉出。由于蛋白质的组成不同，其性质便不相同，因而沉淀时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵只能沉淀球蛋白，饱和硫酸铵才能沉淀清蛋白。盐析沉淀蛋白质往往不引起变性，所以常用于分离各种天然蛋白质。[操作]1.取一试管，加入3毫升5%蛋白质溶液及3毫升饱和硫酸铵溶液，摇匀，此时溶液成为半饱和硫酸铵溶液。静置数分钟，有什么现象发生？析出的蛋白质沉淀是哪一种？2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达到饱和状态，此时析出的蛋白质是哪一种？（注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆）
实验一、基本操作 （准备刻度吸管、试管、试管刷、烧杯、洗耳球、洗涤剂及蒸馏水等） 实验二、蛋白质的沉淀凝固 [原理] 蛋白质带有许多正负电荷，在水溶液中呈现两性电解质，又有许多亲水基团，因此其水溶液有一定的稳定性。但 经某些方法处理后，破坏其电荷性及亲水性，蛋白质则又很易从溶液中沉淀出来。促使蛋白质沉淀的因素很多，大致 可分两类： 第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析 和低温乙醇沉淀蛋白。 第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶 于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而 变成坚实的凝块。 [试剂] 1．5％蛋白质溶液：取出鸡蛋清用水稀释 20 倍，即相当 5％蛋白质溶液。 2．饱和硫酸铵溶液 3. 硫酸铵结晶粉末 4. 95％乙醇（AR） 5．1％乙酸 6．3％硝酸银溶液 7．1％硫酸铜 一、蛋白质的盐析 [原理] 用高浓度的中性盐，使蛋白质的荷电性受到破坏并能去掉蛋白质的水化膜，以致失去稳定性而沉出。由于蛋白质 的组成不同，其性质便不相同，因而沉淀时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵只能沉淀球蛋白，饱和 硫酸铵才能沉淀清蛋白。盐析沉淀蛋白质往往不引起变性，所以常用于分离各种天然蛋白质。 [操作] 1．取一试管，加入 3 毫升 5％蛋白质溶液及 3 毫升饱和硫酸铵溶液，摇匀，此时溶液成为半饱和硫酸铵溶液。静 置数分钟，有什么现象发生？析出的蛋白质沉淀是哪一种？ 2．将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达到饱和状态，此时析出的蛋白质是哪一种？ （注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆）
3.取上项混浊液，加10毫升水，观察沉淀是否复溶。二、乙醇沉淀蛋白质[原理]乙醇能够破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。在室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀反应。但在低温下，可以避免乙醇的变性作用。[操作]1.试管4支，标以1、2、3、4号码，按下表操作：12试剂3411105%蛋白质溶液（ml）0001%乙酸（滴）1~2020095%乙醇（ml）2.将3管及4管置于冰盐浴中，冷却5分钟，然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中并混匀（迅速观察）。同时向第1及第2管中各加入未冷却的95%乙醇2毫升混合均匀。观察各管中的沉淀情况并立即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10毫升，混匀（注意：此步要求迅速），比较各管变化并解释之。三、重金属盐沉淀蛋白质[原理]在溶液的pH值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与带正电荷的重金属离子结合成盐而沉出。[操作]取试管4支，按下表操作：1234试剂55555%蛋白质溶液（滴）00221%乙酸（滴）30301%硫酸铜（滴）03033%硝酸银（滴）混合均匀，比较各管混浊程度并稀释之。实验三双缩脲法测定蛋白质浓度[目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准管法测物质含量的方法（绘制标准曲线）以及分光光度计的使用方法。[原理]双缩脲（NH2CONHCONH2）是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度
3．取上项混浊液，加 10 毫升水，观察沉淀是否复溶。 二、乙醇沉淀蛋白质 [原理] 乙醇能够破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。在室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆 的沉淀反应。但在低温下，可以避免乙醇的变性作用。 [操作] 1．试管 4 支，标以 1、2、3、4 号码，按下表操作： 试剂 1 2 3 4 5％蛋白质溶液（ml） 1 1 1 0 1％乙酸（滴） 0 1～2 0 0 95％乙醇（ml） 0 0 0 2 2．将 3 管及 4 管置于冰盐浴中，冷却 5 分钟，然后将第 4 管的冰乙醇倒入第 3 管中并混匀（迅速观察）。同时向 第 1 及第 2 管中各加入未冷却的 95％乙醇 2 毫升混合均匀。观察各管中的沉淀情况并立即向第 1、2 及 3 管中各加入蒸 馏水 10 毫升，混匀（注意：此步要求迅速），比较各管变化并解释之。 三、重金属盐沉淀蛋白质 [原理] 在溶液的 pH 值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与带正电荷的重金属离子结合成盐而沉出。 [操作] 取试管 4 支，按下表操作: 试剂 1 2 3 4 5％蛋白质溶液（滴） 5 5 5 5 1％乙酸（滴） 0 0 2 2 1％硫酸铜（滴） 3 0 3 0 3％硝酸银（滴） 0 3 0 3 混合均匀，比较各管混浊程度并稀释之。 实验三 双缩脲法测定蛋白质浓度 [目的] 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准管法测物质含量的方法（绘制标准曲线）以及分光光度计的使用方法。 [原理] 双缩脲(NH2CONHCONH2) 是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，此反 应称为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱 性溶液中也能与 Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色 法测定蛋白质浓度
双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONHz、-CH,NH,、-CS-NH,等基团也有此反应。[器材]分析天平、分光光度计、恒温水浴箱、试管、吸量管等[试剂]1.双缩脉试剂：称取1.5g硫酸铜（CuS04：5H20）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H406·4H20）溶解于500ml蒸馅水中，在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。2.0.9%NaC1（生理盐水）。3.蛋白质标准液（70g/L)：每100克蛋清中约含蛋白质10克~11克。用生理盐水对蛋清进行稀释配制成70g/L的溶液，作为蛋白质标准液。4.样品血清：兔血清用生理盐水稀释（10倍或20倍）后再测定，置于冰箱保存备用。[操作]取中试管3支，按下表操作：管号空白管标准管测定管70g/L蛋白溶液（ml）0.1一血清（ml）0.1--0.1 生理盐水（ml）-一双缩脲试剂（ml）4.04.04.0各管混匀、放置37℃水浴中保温15分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。[计算]血清中蛋白质含量（g/L)=（A测/A标）XC标×血清的稀释倍数实验四、还原糖含量的测定（35一二硝基水杨酸法）[目的要求]了解和掌握还原糖含量测定的原理和方法。[实验原理]在NaOH存在下，3,5一二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成棕红色的氨基化合物，该有色化合物在540nm处具有稳定的吸收峰。在一定的浓度范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系，且还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中还原糖的含量。[试剂]1.3,5一二硝基水杨酸（DNS）试剂
双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差， 而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2 等基团也有此反应。 [器材] 分析天平、分光光度计、 恒温水浴箱、 试管、 吸量管等 [试剂] 1．双缩脲试剂：称取 1.5g 硫酸铜（CuSO4·5H2O）和 6.0g 酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）溶解于 500ml 蒸馏水 中，在搅拌下加入 300ml 10％氢氧化钠溶液，用水稀释到 1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。 2．0.9％NaCl（生理盐水）。 3．蛋白质标准液(70g／L)：每 100 克蛋清中约含蛋白质 10 克~11 克。用生理盐水对蛋清进行稀释配制成 70g／L 的溶液,作为蛋白质标准液。 4．样品血清:兔血清用生理盐水稀释（10 倍或 20 倍）后再测定，置于冰箱保存备用。 [操作] 取中试管 3 支，按下表操作： 管号 空白管 标准管 测定管 70g／L 蛋白溶液（ml） — 0.1 — 血清（ml） — — 0.1 生理盐水（ml） 0.1 — — 双缩脲试剂（ml） 4.0 4.0 4.0 各管混匀、放置 37℃水浴中保温 15 分钟。用 540nm 比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 [计算] 血清中蛋白质含量(g／L)=（A 测/A 标）×C 标×血清的稀释倍数 实验四、还原糖含量的测定（3,5－二硝基水杨酸法） [目的要求] 了解和掌握还原糖含量测定的原理和方法。 [实验原理] 在 NaOH 存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成棕红色的氨基化合物，该有色化合物在 540nm 处具有稳定的吸收峰。在一定的浓度范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系，且还原糖的量 与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中还原糖的含量。 [试剂] 1. 3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂
6.3gDNS和262ml的2mo1/L氢氧化钠，加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000m，置手棕色瓶中。2.葡萄糖标准溶液（1mg/ml）精密称取已经干燥恒重的葡萄糖1g，加少量水溶解后再加8ml的12mo1/L浓盐酸（防止微生物生长），用蒸馏水定容到1000ml。[操作]取3支试管，按下表操作：管号空白管标准管测定管0.2Glc标准液（ml）一I0. 2待测液（ml）一一0.2蒸馏水（ml）一一1. 03，5一二硝基水杨酸试剂（ml）1.01. 0混合均匀，沸水浴加热5分钟，取出，用水冷却，再分别加水4.0ml置于分光光度计上，用空白管调零，在540nm处测定吸光度值。[计算]待测液中还原糖的含量（mg/ml)=（A/A标）XC标实验五、尿淀粉酶活性的测定（Winslow氏法）【实验目的]1.熟悉酶活力单位等的定义。2.掌握尿淀粉酶活性的测定的原理和方法。[原理]酶催化一定化学反应的进行，酶含量极微，其绝对量不易测知，通常测一定条件下，酶所催化的反应速度，称为酶活性。临床上常用Wins1ow氏法测定尿或血清中淀粉酶活性。该法对淀粉酶活性单位的规定是：在37℃，C1-存在下，30分钟内能将0.1%淀粉溶液1ml水解的酶量定为淀粉酶的一个活性单位。[试剂]1.0.9%NaC12.稀碘液（0.01mol/L）3.0.1%淀粉溶液：准确称取可溶淀粉1.0g，放烧杯中加少量蒸馏水（约5m1），调成糊状，向烧杯中倾入刚煮沸的蒸馏水约100ml。随加随搅拌，应呈近乎透明的均匀溶液，否则继续煮沸1分钟，冷至室温移入1000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。[器材]37℃恒温水浴箱、中试管10支、刻度吸管1ml，10ml（各2支[操作]
6.3g DNS 和 262ml 的 2mol/L 氢氧化钠，加到 500ml 含有 182g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上 5g 重蒸酚和 5g 亚硫 酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到 1000ml,置于棕色瓶中。 2.葡萄糖标准溶液（1mg/ml） 精密称取已经干燥恒重的葡萄糖 1g,加少量水溶解后再加 8ml 的 12mol/L 浓盐酸（防止微生物生长），用蒸馏水定容到 1000ml。 [操作] 取 3 支试管，按下表操作： 管号 空白管 标准管 测定管 Glc 标准液（ml） — 0.2 — 待测液（ml） — — 0.2 蒸馏水（ml） 0.2 — — 3,5－二硝基水杨酸试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 混合均匀,沸水浴加热 5 分钟，取出，用水冷却，再分别加水 4.0ml 置于分光光度计上，用空白管调零，在 540nm 处测定吸光度值。 [计算] 待测液中还原糖的含量(mg/ml)=（A 测/A 标）×C 标 实验五、尿淀粉酶活性的测定（Winslow 氏法） [实验目的] 1.熟悉酶活力单位等的定义。 2.掌握尿淀粉酶活性的测定的原理和方法。 [原理] 酶催化一定化学反应的进行，酶含量极微，其绝对量不易测知，通常测一定条件下，酶所催化的反应速度，称为 酶活性。临床上常用 Winslow 氏法测定尿或血清中淀粉酶活性。该法对淀粉酶活性单位的规定是：在 37℃，Cl－存在下， 30 分钟内能将 0.1％淀粉溶液 1ml 水解的酶量定为淀粉酶的一个活性单位。 [试剂] 1．0.9％NaCl 2．稀碘液（0.01mol/L） 3．0.1％淀粉溶液：准确称取可溶淀粉 1.0g，放烧杯中加少量蒸馏水（约 5ml），调成糊状，向烧杯中倾入刚煮沸 的蒸馏水约 100ml。随加随搅拌，应呈近乎透明的均匀溶液，否则继续煮沸 1 分钟，冷至室温移入 1000ml 容量瓶中， 加蒸馏水稀释至刻度。 [器材] 37℃恒温水浴箱、中试管 10 支、刻度吸管 1ml，10ml（各 2 支） [操作]
1.取10支试管，按顺序标记（1～10），各加1ml0.9%NaC1。2.用刻度吸管向第1管中加尿液1ml，使与0.9%NaC1混合均匀后，用同一吸管吸取混合液1ml移入第2试管中。3.用同法处理第2管，即混匀后从第2试管中吸取混合液1ml，移入第3试管中，依次类推，如此继续稀释至第9管，从第9管中吸出1ml弃去，这样即可获得分别含尿液为1/2、1/4、1/8....·1/512的不同浓度的尿稀释液（倍倍稀释法）。第10管不加尿液作为对照管。4.第10管起，依次迅速准确各加入0.1%淀粉溶液1ml迅速摇匀，移至37℃水浴中，保温30分钟。5.保温30分钟后，立即取出各管，向各管中迅速加入稀碘液2滴，摇匀，观察各管的颜色。各试管中出现由黄到蓝的色序。黄色表明无淀粉存在，仅呈碘颜色，淀粉遇碘呈蓝色，蓝色或紫红色表示尚有未水解的淀粉存在，淀粉的水解产物糊精遇碘呈红色。故呈黄到红色的各管，表示淀粉已被尿液中的淀粉酶水解。[注]本实验要求0.9%NaCl，0.1%淀粉溶液用10ml刻度吸管吸量。[计算]找出不带蓝色调的尿稀释倍数最大的管，例如第5管，已知在第5管内含尿液1/2ml。即1/32ml尿液也能在37℃，30分钟水解0.1%淀粉溶液1ml，求出1ml尿液水解0.1%淀粉溶液Xml。即每毫升尿液中所含淀粉酶的活性为32个活性单位。[临床意义]正常人的尿中含很少量的由胰腺及睡液腺分泌的淀粉酶，通常1ml尿液所含淀粉酶为8～64单位，但胰腺炎、腮腺炎、胆道疾患时排出增多，因此，测定尿中淀粉酶的活性具有临床诊断价值。实验六、血清尿素氮含量的测定（二乙酰一法）[目的]掌握测定血清尿素氮的原理和方法。[原理]尿素是体内氨基酸分解代谢的最终产物之一。氨基酸经脱氨基作用生成氨，氨对动物机体具有毒性。肝细胞具有使氨生成尿素的作用，所以尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。肝脏合成的尿素通过血液运输至肾脏，由尿液中排出体外。所以血中尿素的来源是肝脏，而去路是通过肾脏的排泄作用。利用血液及尿中尿素氮含量可作为肾脏排泄功能的检验。本实验采用二乙酰一法测定血清尿素氮，测定血清或血浆尿素氮的正常值为5～19mg/100ml。二乙酰一法系根据双乙酰与尿素形成二嗪衍生物的有色复合物的显色反应。由手双乙酰本身不稳定，故用二乙酰一来代替，其反应式如下：i NOH00CH,-I-T-CH, + H.O -H CH,-I_T-CH, + NH:OH二乙酰-肟双乙酰羟胺NHz10CH,H+C=OCH,-C-C-CH, +C=N+ 2H,OC=CNH.C=NCH,双乙酰尿素二衍生物（有色复合物）
1．取 10 支试管，按顺序标记（1～10），各加 1ml 0.9％NaCl。 2．用刻度吸管向第 1 管中加尿液 1ml，使与 0.9％NaCl 混合均匀后，用同一吸管吸取混合液 1ml 移入第 2 试管中。 3．用同法处理第 2 管，即混匀后从第 2 试管中吸取混合液 1ml，移入第 3 试管中，依次类推，如此继续稀释至第 9 管，从第 9 管中吸出 1ml 弃去，这样即可获得分别含尿液为 1/2、1/4、1/8.1/512 的不同浓度的尿稀释液（倍倍 稀释法）。第 10 管不加尿液作为对照管。 4．第 10 管起，依次迅速准确各加入 0.1％淀粉溶液 1ml 迅速摇匀，移至 37℃水浴中，保温 30 分钟。 5．保温 30 分钟后，立即取出各管，向各管中迅速加入稀碘液 2 滴，摇匀，观察各管的颜色。 各试管中出现由黄到蓝的色序。黄色表明无淀粉存在，仅呈碘颜色，淀粉遇碘呈蓝色，蓝色或紫红色表示尚有未 水解的淀粉存在，淀粉的水解产物糊精遇碘呈红色。故呈黄到红色的各管，表示淀粉已被尿液中的淀粉酶水解。 [注]本实验要求 0.9％NaCl，0.1％淀粉溶液用 10ml 刻度吸管吸量。 [计算] 找出不带蓝色调的尿稀释倍数最大的管，例如第 5 管，已知在第 5 管内含尿液 1/2 5 ml。 即 1/32ml 尿液也能在 37℃，30 分钟水解 0.1％淀粉溶液 1ml，求出 1ml 尿液水解 0.1％淀粉溶液 Xml。 即每毫升尿液中所含淀粉酶的活性为 32 个活性单位。 [临床意义] 正常人的尿中含很少量的由胰腺及唾液腺分泌的淀粉酶，通常 1ml 尿液所含淀粉酶为 8～64 单位，但胰腺炎、腮 腺炎、胆道疾患时排出增多，因此，测定尿中淀粉酶的活性具有临床诊断价值。 实验六、血清尿素氮含量的测定（二乙酰一肟法） [目的] 掌握测定血清尿素氮的原理和方法。 [原理] 尿素是体内氨基酸分解代谢的最终产物之一。氨基酸经脱氨基作用生成氨，氨对动物机体具有毒性。肝细胞具有 使氨生成尿素的作用，所以尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。肝脏合成的尿素通过血液运输至肾脏，由尿液中排出 体外。所以血中尿素的来源是肝脏，而去路是通过肾脏的排泄作用。利用血液及尿中尿素氮含量可作为肾脏排泄功能 的检验。 本实验采用二乙酰一肟法测定血清尿素氮，测定血清或血浆尿素氮的正常值为 5～19mg/100ml。二乙酰一肟法系 根据双乙酰与尿素形成二嗪衍生物的有色复合物的显色反应。由于双乙酰本身不稳定，故用二乙酰一肟来代替，其反 应式如下：