答的能力,以抑制疟原虫的发育增殖,但疟原虫也有强大的适应能力 来对抗宿主的免疫杀伤作用。疟原虫具有逃避宿主免疫效应的现象 称为免疫逃避( lmmune evasion)。免疫逃避的机理十分复杂,与之 有关的因素包括下列几个方面 1)寄生部位:不论红细胞外期或红细胞内期,疟原虫均主要在 宿主细胞内生活。可以逃避宿主的抗体作用 2)抗原变异( antigenic varlation)和抗原差异( antigenic diversity):即与前身抗原性稍有改变的变异体。诺氏疟原虫在慢性 感染的猴体内每次再燃都有抗原变异。大量证据说明在同一疟原虫虫 种内存在着许多抗原性有差异的株 3)改变宿主的免疫应答性:患急性疟疾时,机体的免疫应答性 和淋巴细胞亚群在外周血液、脾和淋巴结中的分布都有明显改变。 般均有T细胞的绝对值减少,B细胞相对值增加,与此同时,表现有 免疫抑制、多克隆淋巴细胞活化,毒杀淋巴细胞抗体 ( I ymphocytotoxic antibody)及可溶性循环抗原等。 (5)疟疾疫苗:随着科学的迅速发展,人们对疟原虫和机体两 者的相互关系有了日益深入的了解,从而为免疫学研究的最终目标 疟疾疫苗的研制创造了十分有利的条件。 疟疾疫苗可分为子孢子疫苗(抗感染疫苗)、肝期疫苗(红外期 疫苗)、无性血液期疫苗(红内期疫苗及裂殖子疫苗)和有性期疫苗 (配子疫苗,传播阻断性疫苗)。 疟疾疫苗的研究可追溯到1910年,当时试图用子孢子免疫鸟使之产生抗疟作用。此后,多数使用各 种灭活或减毒的子孢子和疟原虫感染的红细胞。虽免疫效果好,但由于全虫抗原来源有限及伴随的免疫抑 制和自身免疫等问题而不能广泛应用。进入八十年代后随着分子生物学技术的发展,对疟原虫各种抗原基 因背景有了较大的发展。对各抗原的免疫性,T、B细胞位点有了比较明确的了解,从中筛选和不断发现有 苗头的侯选疫苗抗原。但由个别抗原构成的单价疫苗效果并不理想,多价疫苗免疫被认为是当前有效的疫 苗免疫方法。Sp66和 HRPIL-SERA( serine-repeat antigen)MSA1这两种复合疫苗虽起初免疫保护结果相 当成功,但由于地区或虫种,宿主病人等的变化出现保护性低,甚至出现无保护力的结果
-16- 答的能力，以抑制疟原虫的发育增殖，但疟原虫也有强大的适应能力 来对抗宿主的免疫杀伤作用。疟原虫具有逃避宿主免疫效应的现象， 称为免疫逃避（immune evasion）。免疫逃避的机理十分复杂，与之 有关的因素包括下列几个方面： 1）寄生部位：不论红细胞外期或红细胞内期，疟原虫均主要在 宿主细胞内生活。可以逃避宿主的抗体作用。 2）抗原变异（antigenic variation）和抗原差异（antigenic diversity）：即与前身抗原性稍有改变的变异体。诺氏疟原虫在慢性 感染的猴体内每次再燃都有抗原变异。大量证据说明在同一疟原虫虫 种内存在着许多抗原性有差异的株。 3）改变宿主的免疫应答性：患急性疟疾时，机体的免疫应答性 和淋巴细胞亚群在外周血液、脾和淋巴结中的分布都有明显改变。一 般均有 T 细胞的绝对值减少，B 细胞相对值增加，与此同时，表现有 免 疫 抑 制 、 多 克 隆 淋 巴 细 胞 活 化 ， 毒 杀 淋 巴 细 胞 抗 体 （lymphocytotoxic antibody）及可溶性循环抗原等。 （5）疟疾疫苗：随着科学的迅速发展，人们对疟原虫和机体两 者的相互关系有了日益深入的了解，从而为免疫学研究的最终目标— 疟疾疫苗的研制创造了十分有利的条件。 疟疾疫苗可分为子孢子疫苗（抗感染疫苗）、肝期疫苗（红外期 疫苗）、无性血液期疫苗（红内期疫苗及裂殖子疫苗）和有性期疫苗 （配子疫苗，传播阻断性疫苗）。 疟疾疫苗的研究可追溯到 1910 年，当时试图用子孢子免疫鸟使之产生抗疟作用。此后，多数使用各 种灭活或减毒的子孢子和疟原虫感染的红细胞。虽免疫效果好，但由于全虫抗原来源有限及伴随的免疫抑 制和自身免疫等问题而不能广泛应用。进入八十年代后随着分子生物学技术的发展，对疟原虫各种抗原基 因背景有了较大的发展。对各抗原的免疫性，T、B 细胞位点有了比较明确的了解，从中筛选和不断发现有 苗头的侯选疫苗抗原。但由个别抗原构成的单价疫苗效果并不理想，多价疫苗免疫被认为是当前有效的疫 苗免疫方法。Spf66 和 HRPII-SERA（serine-repeat antigen）-MSA1 这两种复合疫苗虽起初免疫保护结果相 当成功，但由于地区或虫种，宿主病人等的变化出现保护性低，甚至出现无保护力的结果
1994年美国海军医学研究院的 Sedegah和 Hoffman等首次报道了疟疾核酸疫苗的研究结果,他们将 编码约氏疟原虫CSP基因克隆入真核表达载体,免疫 BALB/c小鼠后诱导出明显的抗体反应和明显的CTL 反应,其反应水平高于减毒子孢子免疫的小鼠。以子孢子攻击后68%小鼠获得保护。随后,又在猴体和人 体进行了DNA疫苗实验,均产生了免疫效果。红外期疫苗可防止蚊虫叮咬使子孢子感染人,对于所有人群 均适用。但因子孢子或肝期疟原虫在人体内停留时间短,诱发的免疫反应弱,要保证对红外期的免疫力 必须多次接种红外期疫苗 红内期疫苗是可以通过杀死或减少致病的红内期疟原虫来减少疟疾病发率或减少死亡率,红内期DNA 疫苗1998年才有所报道,主要集中在裂殖子表面蛋白1(MSP1)上,但对其抗体反应和保护性水平,有待 进一步研究。 传播阻断DNA疫苗的研究目前仅见Lobo等的报道,他们将含Ps25和Pg27基因的重组质粒免疫 小鼠,Pfs25的DNA诱导的抗体可使蚊感染率下降75%,合子数量减少97%。Pg27的DNA诱导的抗体有 中等程度的效果。目前正用于I期临床试验 DNA免疫技术为疟疾疫苗的研制开拓了一条前所未有的新途径。自此项技术应用于疟疾核酸疫苗的研 制后,在短短的几年间,已有多种DNA疫苗使用于动物模型的研究,并可诱导出CD8T细胞应答。研究 表明,用二价DNA疫苗或多价疫苗或多种单价疫苗联合免疫有可能克服远交系动物因遗传背景而限制的免 疫应答。尽管如此,在设计与构建能诱导保护性免疫应答的核酸疫苗方面尚存在许多问题。从疟疾基因组 计划可获得许多基因的信息,并很快在DNA疫苗研制中得到了应用。另外,应用基因技术可从基因库中鉴 定并筛选出可编码保护性抗原的基因,也将有利于疟疾疫苗的研制。 【实验诊断】 病原学诊断 (1)血膜染色镜检:从患者周围血液中检岀疟原虫是疟疾确诊 的依据。取外周血制作厚、薄血膜,经姬氏或瑞氏染剂染色后镜检査 找疟原虫。薄血膜中疟原虫形态完整,被感染红细胞未被破坏,容易 识别和鉴别虫种,但原虫密度低时,容易漏检。厚血膜由于原虫集中 易检获,其检出率是薄血膜的15~25倍,但制片过程中红细胞溶解, 原虫形态有所改变,虫种鉴别较困难。基于此,最好一张玻片上同时 制作厚、薄两种血膜。选择适宜的采血时间:恶性疟在发作开始时, 间日疟在发作后数小时至10余小时采血 (2)血沉棕黄层定量分析法( quant itative buffy coat,QBC):近 年用于疟疾诊断,原理是感染疟原虫的红细胞比正常红细胞轻,而比 白细胞略重,离心分层后,集中分布于正常红细胞层的上部,在加入 橙试剂后,用荧光显微镜观察结果。其敏感性比普通镜检法髙7倍
-17- 1994 年美国海军医学研究院的 Sedegah 和 Hoffman 等首次报道了疟疾核酸疫苗的研究结果，他们将 编码约氏疟原虫 CSP 基因克隆入真核表达载体，免疫 BALB/c 小鼠后诱导出明显的抗体反应和明显的 CTL 反应，其反应水平高于减毒子孢子免疫的小鼠。以子孢子攻击后 68%小鼠获得保护。随后，又在猴体和人 体进行了 DNA 疫苗实验，均产生了免疫效果。红外期疫苗可防止蚊虫叮咬使子孢子感染人，对于所有人群 均适用。但因子孢子或肝期疟原虫在人体内停留时间短，诱发的免疫反应弱，要保证对红外期的免疫力， 必须多次接种红外期疫苗。 红内期疫苗是可以通过杀死或减少致病的红内期疟原虫来减少疟疾病发率或减少死亡率，红内期 DNA 疫苗 1998 年才有所报道，主要集中在裂殖子表面蛋白 1（MSP1）上，但对其抗体反应和保护性水平，有待 进一步研究。 传播阻断 DNA 疫苗的研究目前仅见 Lobo 等的报道，他们将含 Pfs25 和 Pfg27 基因的重组质粒免疫 小鼠，Pfs25 的 DNA 诱导的抗体可使蚊感染率下降 75%，合子数量减少 97%。Pfg27 的 DNA 诱导的抗体有 中等程度的效果。目前正用于Ⅰ期临床试验。 DNA 免疫技术为疟疾疫苗的研制开拓了一条前所未有的新途径。自此项技术应用于疟疾核酸疫苗的研 制后，在短短的几年间，已有多种 DNA 疫苗使用于动物模型的研究，并可诱导出 CD8+T 细胞应答。研究 表明，用二价 DNA 疫苗或多价疫苗或多种单价疫苗联合免疫有可能克服远交系动物因遗传背景而限制的免 疫应答。尽管如此，在设计与构建能诱导保护性免疫应答的核酸疫苗方面尚存在许多问题。从疟疾基因组 计划可获得许多基因的信息，并很快在 DNA 疫苗研制中得到了应用。另外，应用基因技术可从基因库中鉴 定并筛选出可编码保护性抗原的基因，也将有利于疟疾疫苗的研制。 【实验诊断】 1．病原学诊断 （1）血膜染色镜检：从患者周围血液中检出疟原虫是疟疾确诊 的依据。取外周血制作厚、薄血膜，经姬氏或瑞氏染剂染色后镜检查 找疟原虫。薄血膜中疟原虫形态完整，被感染红细胞未被破坏，容易 识别和鉴别虫种，但原虫密度低时，容易漏检。厚血膜由于原虫集中 易检获，其检出率是薄血膜的 15～25 倍，但制片过程中红细胞溶解， 原虫形态有所改变，虫种鉴别较困难。基于此，最好一张玻片上同时 制作厚、薄两种血膜。选择适宜的采血时间：恶性疟在发作开始时， 间日疟在发作后数小时至 10 余小时采血。 （2）血沉棕黄层定量分析法（quantitative buffy coat，QBC）：近 年用于疟疾诊断，原理是感染疟原虫的红细胞比正常红细胞轻，而比 白细胞略重，离心分层后，集中分布于正常红细胞层的上部，在加入 橙试剂后，用荧光显微镜观察结果。其敏感性比普通镜检法高 7 倍
简便,快速。但费用较高,对实验器材有特殊要求 2.免疫学诊断 (1)循环抗体检测:迄今所有实际应用的疟疾血清学试验仍是 基于疟原虫无性期抗体的的检测。抗疟抗体在感染后2~3周出现,4~ 8周达高峰,然后下降。重复感染或复发,抗体上升较快,且抗体的 水平比初次感染高,持续时间长。由于抗体在患者治愈后仍能持续 段时间,且广泛存在着个体差异,因此抗体检测在临床上仅作辅助诊 断,而主要用于疟疾的流行病学调査、防治效果评估及输血对象的筛 选。常用的方法有间接荧光抗体试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附 试验等 (2)循环抗原检测:利用血清学方法检测疟原虫循环抗原,能 更好地说明受检对象是否有活动感染。常用的方法有放射免疫试验、 抑制法酶联免疫吸附试验、夹心法酶联免疫吸附试验等。 近年来,TDR推出一种由单抗等制备的免疫浸条,用于检测疟原 虫感染患者血浆中的特异抗原,简便易行。其中, ParaSight M( Becton Dickinson), ICT Malar ia PfTest (ICT Diagnostics Sydney )/H OptiMALR ( Flow inc portland,OR)诊断试剂盒在国外已商品化并小规模现场 应用。我国学者正在研制中。 3.分子生物学技术随着分子生物技术发展的日新月异和推广, 核酸探针和聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR)已应用 于疟疾的诊断。核酸探针用于恶性疟原虫的检测,敏感性可达感染红 细胞内00001%的原虫密度。PCR的敏感性更高,且操作较简便。国 内学者已建立间日疟和恶性疟套式PCR系统,可以在1次扩增中同 时检测间日疟和恶性疟,并经现场应用,证明此系统结果稳定,灵敏 度高和特异性强
-18- 简便，快速。但费用较高，对实验器材有特殊要求。 2．免疫学诊断 （1）循环抗体检测：迄今所有实际应用的疟疾血清学试验仍是 基于疟原虫无性期抗体的的检测。抗疟抗体在感染后2～3 周出现，4～ 8 周达高峰，然后下降。重复感染或复发，抗体上升较快，且抗体的 水平比初次感染高，持续时间长。由于抗体在患者治愈后仍能持续一 段时间，且广泛存在着个体差异，因此抗体检测在临床上仅作辅助诊 断，而主要用于疟疾的流行病学调查、防治效果评估及输血对象的筛 选。常用的方法有间接荧光抗体试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附 试验等。 （2）循环抗原检测：利用血清学方法检测疟原虫循环抗原，能 更好地说明受检对象是否有活动感染。常用的方法有放射免疫试验、 抑制法酶联免疫吸附试验、夹心法酶联免疫吸附试验等。 近年来，TDR 推出一种由单抗等制备的免疫浸条，用于检测疟原 虫感染患者血浆中的特异抗原，简便易行。其中，ParaSightTM（Becton Dickinson）、ICT Malaria PfTest（ICT Diagnostics Sydney）和 OptiMALR （Flow Inc Portland，OR）诊断试剂盒在国外已商品化并小规模现场 应用。我国学者正在研制中。 3．分子生物学技术 随着分子生物技术发展的日新月异和推广， 核酸探针和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）已应用 于疟疾的诊断。核酸探针用于恶性疟原虫的检测，敏感性可达感染红 细胞内 0.0001％的原虫密度。PCR 的敏感性更高，且操作较简便。国 内学者已建立间日疟和恶性疟套式 PCR 系统，可以在 1 次扩增中同 时检测间日疟和恶性疟，并经现场应用，证明此系统结果稳定，灵敏 度高和特异性强