武汉大学Wuhan University二.蛋白质组分析的基本方法和技术1蛋白质鉴定方法质谱技术出现以前最成功的方法是Edman化学降解法1950年由Edman首先提出Edman化学降解法所使用的试剂是异硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate,PITC)Laboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 二.蛋白质组分析的基本方法和技术 1 蛋白质鉴定方法 质谱技术出现以前 最成功的方法是Edman化学降解法 1950年由Edman首先提出 Edman化学降解法所使用的试剂是异硫氰酸苯酯 （phenylisothiocyanate,PITC）
R.肽与PITC在pH8一9的条HNCHPITC(RI)肤件下反应生成PTC一肽25%三甲酰鲜勇联(R)（苯异硫甲氨酰肽）。R在强酸作用下，可使靠苯异货甲氮肤肤（PTC一肽）近PTC基的氨基酸环化，三氟酷酸（无水）聚纸(B,)肽键断裂形成噻唑啉酮R,苯胺HNCH新生肚(Thiazolinone,ATZ)转化蒙壁明装股护生物25%三家MCATZ-基R衍生物和一个失去末端氨基酸的新生肽链。新生肽链有一个新的N端，PTH-氨基酸图20-2Edman降解法反应示意图可以重复上述反应。Laboratoryof plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 肽与PITC在pH8－9的条 件下反应生成PTC－肽 （苯异硫甲氨酰肽）。 在强酸作用下，可使靠 近PTC基的氨基酸环化， 肽键断裂形成噻唑啉酮 苯胺 （Thiazolinone,ATZ） 衍生物和一个失去末端 氨基酸的新生肽链。新 生肽链有一个新的N端， 可以重复上述反应
武汉大学Wuhan University：如此不断循环，可依次使构成肽链的氨基酸，逐一水解，形成ATZ一衍生物（ATZ-氨基酸极易被有机溶剂抽提，并在水溶液中转化成稳定的乙酰苯硫脲氨基酸phenylthiohydantoin-AA,PTH-氨基酸)·根据上述Edman降解原理进行肽链顺序分析的方法可分为手工测序与自动化测定。Laboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics • 如此不断循环，可依次使构成肽链的氨基酸， 逐一水解，形成ATZ－衍生物(ATZ-氨基酸极易 被有机溶剂抽提，并在水溶液中转化成稳定的 乙酰苯硫脲氨基酸phenylthiohydantoinAA,PTH-氨基酸) • 根据上述Edman降解原理进行肽链顺序分析的方 法可分为手工测序与自动化测定
武汉大学WuhanUniversit利用质谱进行蛋白质鉴定主要有两种方法肽质量指纹谱（Peptide massfingerprint，PMF）法：(1)是在经过蛋白质分离后（如利用2DE技术分离蛋白质），将蛋白质取出，用特定的酶进行酶切，获得肽段混合物，而后进入质谱进行肽段质量的测定，从而获得该蛋白质各切割肽段的质量，通过这些质量搜索已有的数据库，得以进一步识别出该蛋白质(2)串联质谱（Tandemmassspectrum）法：是在蛋白质酶解后，对酶解肽段进一步裂解，并对其裂解产物（各种碎片离子）进行质谱检测，最后利用这些测定的质量反推肽段的氨基酸序列Laboratoryof plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 利用质谱进行蛋白质鉴定主要有两种方法 （1）肽质量指纹谱（Peptide mass fingerprint,PMF）法： 是在经过蛋白质分离后（如利用2DE技术分离蛋白质），将蛋 白质取出，用特定的酶进行酶切，获得肽段混合物，而后进 入质谱进行肽段质量的测定，从而获得该蛋白质各切割肽段 的质量，通过这些质量搜索已有的数据库，得以进一步识别 出该蛋白质 （2）串联质谱（Tandem mass spectrum）法：是在蛋白质酶 解后，对酶解肽段进一步裂解，并对其裂解产物（各种碎片 离子）进行质谱检测，最后利用这些测定的质量反推肽段的 氨基酸序列
武汉大学Wuhan University二.蛋白质组分析的基本方法和技术2.双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis， 2-DGE 或 2-DE )蛋白质组技术的核心。第一向：等电聚焦凝胶电泳(Isoelectrifocusing gel electrophoresis,IEF)第二向：SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳Laboratoryofplant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 二.蛋白质组分析的基本方法和技术 2.双向凝胶电泳 （Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DGE 或 2-DE ） 蛋白质组技术的核心。 第一向：等电聚焦凝胶电泳 (Isoelectrifocusing gel electrophoresis,IEF） 第二向：SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳