武汉大学Wuhan Unixe2-DE: In the beginnino· 1975: P.H. O'Farrell. J. Kloseindependently invent a 2-D proteinelectrophoresis system(1) Isoelectric focusing in ureaand carrier ampholytes in atube gel(2)Size separation in SDS on avertical slab gel-detection by radio-labelingE.coliextractO'Farrell,JBiolChem,1975or Coomassie blue stainingLaboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics • 1975: P.H. O’Farrell, J. Klose independently invent a 2-D protein electrophoresis system (1) Isoelectric focusing in urea and carrier ampholytes in a tube gel (2)Size separation in SDS on a vertical slab gel – detection by radio-labeling or Coomassie blue staining 2-DE: In the beginning E. coli extract O’Farrell, J Biol Chem, 1975
SUMMARYHighResolutionTwcA technique has been developed for the separation ofof Proteins*TIproteins by two-dimensional polyacrylamide gel electro-Vol. 25(nharecie Due tn ite recalutinn and ceneitivitu this technique4)ofproteins:separatedising in thetbysodiumDSdimension.possible tospots acrosssolved 1100I should bes. A proteinin of eitherI.Aproteinotein canbee reproduci-achspotona differentr estimationof proteinscan resolvequently canresulting inchanged by7691011213141516Rdescription11Reehahof themethods as well as the characteristics of this systemLaboratoryofplantmoleculararepresented
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2aD,Electrophoresis: Traditional武汉民学Wuhan UniversityMethodFirstDimension:Second Dimension:IsoelectricSDSPolyacrylamideFocusing inpresenceGelElectrophoresisgel rod rebufferedofurea,Nonidet NP-40in discontinuous gradientgelinSDSbufferin vertical gel rodeePH10pH3sampleSSBEIIMIININRREIRPH10pH3④Separation acc.toSeparationacc.toMolecularWeight (mass)IsoelectricPoints(charge)PrincipleaccordingtoP.H.O'FarrellandJ.Klose(1975)Laboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 2-D Electrophoresis: Traditional Method
武汉大学WuhanUniversity(1) IEF 原理：蛋白质是两性物质，在不同pH溶液下所带净电荷不同，当其净电荷为零时的pH值即为该蛋白的等电点pI。蛋白质在具有pH梯度的电场中，当pH<pI时，向负极移动；pH>pI时，向正极移动。随着移动，蛋白质的净电荷逐渐减小，直至为零，此时pH=pI，蛋白质不再移动而被聚焦。由此可知，等电聚焦是利用具有不同等电点的蛋白质在线形pH梯度下泳动，并聚焦于其pI值相同的pH位置，达到蛋白质混合物分离的方法。Laboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics ⑴ IEF 原理： 蛋白质是两性物质，在不同pＨ溶液下所带净电荷不同， 当其净电荷为零时的pＨ值即为该蛋白的等电点pＩ。蛋 白质在具有pＨ梯度的电场中，当pＨ<pI时，向负极移 动 ；pＨ>pI 时，向正极移动。随着移动，蛋白质的净电 荷逐渐减小，直至为零，此时pＨ＝ pI ，蛋白质不再移 动而被聚焦。 由此可知，等电聚焦是利用具有不同等电点的蛋白 质在线形pＨ梯度下泳动，并聚焦于其 pI值相同的pＨ位 置，达到蛋白质混合物分离的方法
武汉大学Wuhan University线形pH梯度的形成：1).载体两性电解质pH梯度常用两性电解质AmpholineTM，一种多氨基多羟基两性化合物的混合物。MW：300一1000Da，直流电场下，从正极一→负极连续pH梯度，分辨率可达0.01pH单位（图示原理）00-6钱体网生电解质全电场中形成正梯的模式凰Laboratoryofplant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 线形pＨ梯度的形成: 1) .载体两性电解质pＨ梯度 常用两性电解质AmpholineTM ,一种多氨基多羟基 两性化合物的混合物。ＭＷ：300—1000Da,直流电 场 下 ， 从 正 极 → 负 极 连 续 p Ｈ 梯 度 ， 分 辨 率 可 达 0.01pH单位（图示原理）