《草鱼出血病》温度对草鱼出血病影响的初步探讨

维资hpw hpa//www.cqvip.com 毒学杂志2.10 Virologies Sinies 215 温度对草鱼出血病影响的初步探讨 丁清泉余兰芬柯丽华 (中国科学院武汉病毒研究所,武汉430071 提 / 将鱼呼肠孤病毒(FRV)感染的草鱼饲养在人工控温的水族箱内,水温在24-30℃ 恒温时其死亡率无显著差异(P>0.05),而在20℃和33℃恒温时死亡率则明显降低,与 24℃-30℃恒温相比死亡率有非常显差异(P<0.01)工感染恒温饲养期间,死亡 高峰期随水温降低而推迟,缓慢改变水温能降低死亡率,在低于20℃攻毒并维持一星期 左右,即使逐步升温至30℃也不会导致感染鱼的大批死亡。 关键词:鱼呼肠孤病毒草鱼出血病温度 根据初步研究认为草鱼出血病的病原系鱼呼肠孤病毒2流行病学研究表明:草 鱼出血病流行的季节性很强,在夏秋气温高的季节爆发流行,而在冬春季节则不流行 鱼类是变温动物,水温不仅直接影响鱼体内的新陈代谢,而且也在疾病的流行过程中起 重要作用。我们在室内人工感染增殖病毒的过程中,就温度对草鱼出血病的影响进行了 初步探讨,现将结果报道如下。 材料和方法 1.鱼呼肠孤毒株:从邵阳市水产科学研究所提供的草鱼出血病病鱼中分离 2.健康草鱼鱼种:由湖北省野芷湖水产良种场提供 3.人工感染:取患草鱼出血病症状明显的病鱼内脏加入少量0.01mol/L磷酸缓冲液匀浆 经冻融二次,按每克内脏加3-5m补足磷酸缓冲液,加双抗处理。每尾鱼腹腔注射0.3一 0.4ml,在水族箱中控温通气饲养。 人工感染后死亡鱼按已报道的方法解剖观察其肌内及内脏病理学变化,同时经初提纯后在 电镜下观察以确证是否病毒感染所致151。 结果 一、电镜观察 取入工感染死亡后的病鱼内脏(肾、旰、脾、肠)经差异离心初步提纯,负染色后 本文于1989年5月25日收到 本文表1表2的统计学数据处理承北医学院陈冬老师助完成,特此致

．I●学杂毒 V 0logiea 2． 1950 S抽 ie● 2l5 温度对草鱼出血病影响的初 步探讨 丁清泉 余兰芬 柯 丽华 (中园 科学 武 汉病毒 研究所 ．~ 430071) 提 要 ， 将 鱼 呼肠 孤 病 毒 (FRV )感 染 的 草 鱼饲 养 在 人工 控 温 的水 族 箱 内， 水 温 在 24- 30~ 恒 温 时 其 死 亡率 无 显 著 差 异 (P> 0．05)．而 在20℃ 和 33℃ 恒温 时 死 亡 率 则明 显 降 低 ， 与 24℃ 一 30℃ 恒温 相 比死 亡 率 有 非 常显 著差 异 (P<0．O1)。 人 工 感染 恒 温 饲 养 期 间， 死亡 高 峰期 随 水 温 降低 而 推 迟， 缓 慢 改变 水 温 能降低 死 亡 率 ， 在低 于20℃ 攻 毒并 维 持一 星 期 左 右 ， 即 使逐 步 升 温 至 30℃ 也不 会 导 致 感 染 鱼的 大 批 死 亡 。 关麓 词： 鱼呼肠孤病 毒 草鱼出血病 温度 根据 初步研究认为草 鱼出血病的病原系鱼 呼肠 孤病毒 。流 行病 学研 究表明t草 鱼出血病流行 的季节 性很强 ，在夏秋气 温高 的季节爆 发流行，而在 冬春季节则不流 行 。 鱼 类 是 变 温 动 物 ， 水 温 不 仅 直接 影 响 鱼 体 内 的 新 陈 代 谢 ， 而 且 也 在 疾 病 的流 行过 程 中 起 重 要作用。我们在 室内人工 感染增殖病毒 的过 程中，就 温度 对草鱼出血病的影响进行 了 初 步 探 讨 ， 现 将 结 果 报 道 如 下。 材 料 和 方 法 1．量呼腑孤■毒株：从邵 阳市水产科学研究新 提供的患草鱼 出血病病鱼申分离。 2．蕾 糜 簟 量量 种 ： 由湖北 省 野 芷 湖 水 产 良种 场 提 供o 5． ^工 巷 染 ： 取 患草 鱼 出 血 病症 状 明 显 的 病 鱼 内脏 加 入 少量 0．0Imol／L磷 酸 缓冲 液 句 浆， 经 冻 融 二 次 ，按 每 克 内 耻 加 3一 sml量补 足 磷 酸 缓 冲 液， 加 双抗 处 理 a 每 尾 鱼 腹 腔 注 射 0．3- 0．4ml， 在水 族 箱 申 控 温通 气 饲 养 。 ^ 工感 染 后 死 亡鱼 按 已报 道 的方 法 解 剖 观 察 其肌 肉及 内脏 病 理 学 变 化 ll， 同时 经初 提 纯 后 在 电镜 下 观察 咀确 证 是 否 病毒 感 染所 致 I5】n 结 果 一 、 电镜 观 察 取人工 感染死亡后的病鱼 内脏 (肾、旰、脾 、肠 )缢差 异离心 初步提 纯， 负染色后 本文 ~1989年 5月P5日嘘到 奉文 表 l表 2柏统 计学 数据赴 理承湖北 医学 院沫冬 域老师协助 完成， 特此致 谢 维普资讯 http://www.cqvip.com

216 剩串学杂志21 Vtol●aai 图1.从发病充亡鱼内分离的病毒粒子 Figl virions isolated from dead grass carp 在电镜下可见典型的病毒粒子(图1),与已报道的形态基本相同。证实人工感染死 亡确系病毒感染所致。 恒温饲养对草鱼发病的影响 将人工感染草鱼放入不同水族箱内,水温分别控制在20℃、24C、27℃、30℃和 33℃。另设未感燊健康鱼〔注射等量磷酸缓冲液)对照水浴箱,温度控制在28℃。逐日 统计发病死亡数(24小时内死亡数不在统之列),直至死亡不再发生,感染鱼游动正 常并大量板食时为止15天后,未死亡的感染鱼一般不再死亡。三次试验结果见袤1。经 统计学的x2测验处理数据,各次试验中20℃-33℃恒温时各温度组致死率有非常显 著差异(P<0,01),但其中24℃-30℃则无显著差异(P>0,05)。经x2检验和超几 何分布的直接概率法(精确法)计算同一温度的3次结果均无显蓍性差别,故将三次结 1愎饲养时发死亡能计培暴 T&b1e1 Dead statistios of int·ted惑 ras carp in constant water temperat了 实趾组 c28 感染 死亡数 致死率(% 70。8 91.3 感染數 18 距302 20 死亡数 致死率() 100 67,1 感染数 死亡数 致死率(师) 68.0 85 85,2 46,9 感染 死亡数 37 致死率(哂) 89.3992191.43924151,39

2le 翥毒举亲志 盘 1．．1． V irollgle* ● ‘n 在 电镜下可见典型 的病毒 粒子 (图 1 )，与已报道的形态基本相同 。 证实人工 感染死 亡 确系 病毒感染所致。 二 ，恒温饲养对草鱼 发病 的影响 将人 工惑 染草鱼放入不同术族 箱内，术 温分 别控 制 在 z0℃、24℃、27℃、30℃ 和 33"C。 另设未感 染健 康鱼 (注射等量磷酸 缓雄液 )对照水 ?{}箱，温度 控制在28℃。逐 日 统 计发病 死亡数 (2l小 时内死亡数 不在统 之刊 )，直至死亡不 再发 生， 感染鱼游动正 常并太量 摄食 耐为 止。I5天 后 ，未 死亡舶感染叠一 般不再死 亡。 三次 试验结果见表 I。 经 统爿 学的 x 测验 处理 数据 ，各次 试验 中 20℃一33℃ 恒 温时 各温 度组致死 率有 非常 显 著 差 异 (P<O．01)， 但 其 中 24℃一 30℃则 无 显蓍 差 异 (P> 0．05)。 经 x 检 验 和 超 几 何分布的直接概率法 (精确法 )计算同一温度的 3次结果均无显著性差别，故将三次结 囊 1 恒 4饵 井时发 ■ 焉亡建计 I言暴 Table 1 Deid st*tislies of infected Brass 4·r辟 如 e0口-t|nt w4‘el t| ，e}·‘tf· 维普资讯 http://www.cqvip.com

弹杂志2 217 果予以合并(表1),同时计算各温度组间的差异,结果显示24℃、27℃、30℃三组致 死率无显者差异,而20℃与33℃二组致死率与上述三组有非常明显的差异(表2),由此 推测33℃和20℃是草鱼出血病流行爆发的上限和下限的临界温度。 囊2x2训验不两度组闯就死富舞 Table 2 Differences of the death-rate of Ihe differenl lemperature with x2 lest 组别(℃) 0.01 11.68 00r 和和和和和 0.0478 20 27.7I 32.0384 人工感染草鱼均有一个与温度有关的爆发死亡高峰期。以表1第Ⅲ组每日病死率作 图(图2),可见温度愈低、死亡高峰期愈迟,24℃-30℃恒温时感染鱼爆发死亡期为 单峰型,24℃死亡高峰在11天,27℃为7天,30℃为5天。33℃为双峰型,20℃则为不 规则型。其它两组试验也证实了上述结果,但死亡高峰时间相差1天左右。 图2.不同水温饲养人工感染鱼发病 20C Fig2.De·d ia different water 1·mtr(WT, 感集天敌Day 温度变化对草鱼发病的影响 5 【12t3141516 熬染数天Dy 图8.降灑惆弊人工感染发病死亡幽线 Dead corve in refuged water tmpep4tap(W, T)

囊●橼 卷 i-t●¨ ViTol●I“● $1Jtte= 2l 果 予以合并 (表 1)，同时讨算 备温度 组 间的差异 ，结 果显示24℃ 、27℃、30℃三组致 死 率无显 著差异。而20℃与33℃二组致 死率 与上述三组有非常 明显 的差 异 (表 2)。由此 推 瓤033℃和 20℃是草鱼 出血寐 流行爆 发的 上限和下限的临界温度。 囊 2 x2一礁军再■虐坦闫t 事■鼻 Table 2． Differences of the death-i-Ire 0f the different temperature with t2 le} 人工感染草 鱼均 有一 个与温度有关 的爆 发死亡高峰 期。 以表 l第 Ⅲ组每 日病死 率作 图 (图 2 )，可见温度 愈低 ，死亡高峰 期愈遇，24℃一30℃恒温 时感染 鱼爆发死 亡期为 单峰型 ，24℃死 亡高 峰在 u天 ，27℃为 7天 ，3o℃为 5天。33℃为双 峰型 ，20℃则为不 规则 型。其它两组试验 也证实 了上述结果 ，但死亡高峰 时间相差 1天左右 · 枷 3。 。。 喜 1o 苫 蓐 肇 天 |宣 D．y 三 、温 度变化对草鱼发病 的影 响 ● 噶 * 年 母 2． 不同 水馄 饲养 ^工 瘩染 鱼发捕 死亡率 曲线 — — 33℃ … ·一 — 一30℃ - 一 - 一 - 一 - 27℃ 一 一 一 - 24lc … … … … … … O1： Fig 2 ． De●d curv~ in differeat water te 'Ⅲ tⅢ (w．T．) 蓐蔡敷 天 Dry 冒 8． 牟_遵饲养^工感染量盅癌死亡由战 F‘ 3． ne·dⅢ ·h r·^ ’d-·t· -p ’_ ‘霄· ) 维普资讯 http://www.cqvip.com

218 病确学杂志2,1·0 Vr·I°Bi·L》温 水温变化对草鱼出血病有明显影响。图3为先降温后升温的发病死亡率曲线,感染 鱼20尾。感染后从高温(30℃)以日均2℃下降,至感染后第8天(水温18℃)死鱼 尾,18℃维持三天后以日均2C升温至30℃后维持恒温,总死亡率为55%,低于同次试 验中30℃恒温饲乔时的死亡(85.79),这表明在感染初期降温能减少鱼的死亡。 图4为升温饲养入J感染鱼发病死亡率曲线,感染鱼30尾。感染后从15℃起以日均 1℃升温至22℃,嗣后以日均2℃升至30℃再维持恒定,在此期间仅死鱼一尾(死亡率 为3·3%),远低于同次试验中30℃、20℃洹温饲的纰亡率(分别为85.7%、46.2%) 15天后对话鱼再次攻毒并维持水温30C,10天内鱼无一死亡,表明人工感染鱼已产 免疫力。 !2345 感染天数Day 图4,升温饲养人工感染鱼死亡曲线 Fag. 4 Dead curve in raised watur temperet 讨论 根据草鱼出血病流行病学调查,每年6-9月是此病的主要流行季节,水温一般在 27℃以上最容易流行。我们在室內控温饲养,发现人工感染草鱼发病死亡与自然界发 病流行一样受温度影响很大。24℃—30℃恒温时发病死亡率经统计学处理无明显差异, 这个温度范围也正好是夏秋时的水温范围。20℃酎鱼发病死亡无明显规律,但明显低于 24℃以上恒温时总的死亡率,20℃可能是该病流行的临界温度。33℃恒温时在感染后48 小时左右出现爆发性死亡,经解剖和镜观察,仍系病毒感染所致,这与罗楞等报道的 结果相似3。我们曾对一些渔场进行了流行病学调查,发现在夏季气温偏高时草鱼出血 病反而不流行。室内人工感染结果经统计学处理33℃与24℃-30℃恒温时的死亡率有非 常显著差异,33℃恒温饲养时各组死亡率均低。因此推测在高于33℃水温时,该病的流 行将受到抑制。在人工感染增殖材料的倩况下以24℃一30℃恒温饲养为宜。 在改变人工感染鱼的饲养温度时,从高温(30℃)逐渐降温可以降低发病死亡率 见图3)。即使在24℃-30℃范围内变化也可以降低发病死亡率(结果未表示)。 范至刚等的隐性感染试验表明在初冬(水温10℃左右)用强毒浸泡的鱼种可以获得 很强的免我力。我们采用腹腔注射攻毒,水温从5℃缓慢升至30℃并维持一段时间,发 柄死亡泽相当低,即使冉次攻毒,也没有出现死鱼现象。这表明在稍低于临界温度的情 况下攻,并不需要很长时间就能使鱼产生免疫力

2le 囊● 掌 荣志 2． 1tgO VjT●I●li●l 5I●I●l 水 温变化对 草鱼 出血病有 明显 影响。图 3为先降温后升 温的发病 死亡率 曲线，感染 鱼 2O尾 。 感 染 后 从高 温 (3O℃ ) 日均 2℃ 下 降 ， 至 感 染 后 第 8天 (水 温 18℃ )死 鱼一 尾 ， 18℃维 持 三 天 后 以 日均 2℃升 温 至 3O℃ 后 维 持 恒 温 ，总 死亡 率 为 55％ ，低 于 同 次 试 验 中3O℃恒温饲养时 的死亡率 (85．7 )，这 表明在 感染 初期降温能减少鱼 的死亡。 图 4为 升 温 饲 养 人 工 感 染 鱼发 病 死 亡 率 曲线 ，惑 染 鱼30尾 。 感 染 后 从 15℃ 起 以 日均 1℃ 升温 至 22℃ ， 嗣 后 以 日均 2℃ 升 至 30℃再 维 持 恒 定 ， 在 此 期 间仅 死 鱼一 尾 (死 亡 率 为 3．3 )，远 低 于 同次 试验 中 30℃ 、20℃ 洹 温 饲 养 的 死 亡 率 (分 别 为 85．7 、 46．2 )。 15天 后 对 存 活 鱼 再 次 攻 毒 并 维持 水 温 30'C， 10天 内鱼 无一 死 亡 ，表 明人 工 感 染鱼 已产 生 免疫 力 。 话 翟 10 ； ： 感染 无数 D Y 尉 4． 升温饲 养人工 感染鱼 死亡 曲线 Fig． 4 Dead … ve ia raieed ur tempcTaturv(w ．T．) 讨 论 根据 草鱼 出血病流 行病学 调查，每年 6— 9月是此病的主要流 行季节，水 温一 般在 27℃以上最容易流行 。 我们 在室内控温饲养 ，发现人 工感染草鱼发病死亡 与 自然 界发 病 流行 一 样 受 温 度 影 响 很 大 。 24℃一 3O℃ 恒 温 时发 病 死 亡率 经统 计学 处 理 无 明显 差 异 ， 这 十 温 度 范 围 也 正 好 是 夏 秋 时 的 水 温 范 围。 20℃对 鱼发 病 死亡 无 明 显 规律 ， 但 明显 低 于 24℃ 以上 恒 温 时 总 的 死 亡 率 ， 20~C可 能 是 该 病 流 行 的 临 界 温 度 。 33℃恒 温 时在 感 染 后 48 小 时 左右 出 现 爆 发 性 死亡 ， 经 解 剖 和 电 镜 观 察 ， 仍 系 病毒 感 染 所 致 ， 这 与 罗 楞 等 报 道 的 结果 相 似 。 我 们 曾 对 一 些 渔 场 进 行 了 流行 病 学 调 查 ， 发 现在 夏 季 气 温 偏 高 时 草 鱼 出血 病反 而不 流行。室内人 工感染 结果 经统 讲学 处理 33℃与24℃～ 30℃恒温时的死亡率有非 常 显 著 差 异 ， 33℃ 恒 温 饲 养 时 各组 死 亡 率 均 低 。 因此 推 测 在 高 于 33℃水 温 时 ， 该 病 的 流 行 将 受到 抑 制 。 在 人 工 感 染 增 殖 材 料 的 情 况下 以 24℃一 30℃恒 温 饲 养 为 宜 在 改 变人 工 感 染 鱼 的 饲 养 温 度 时 ， 从 高 温 (30℃ )逐 渐降 温 可以降 低 发 病 死 亡 率 (见 图 3 )。 即使 在 24℃ 一 3O℃范 围 内 变 化 也 可 以降 低 发 病 死 亡 率 (结 果 未 表示 )。 范 至 刚等 的 隐 性感 染 试 验 表 明 在 初冬 (水 温 10'C左 右 )用 强 毒 浸 泡 的 鱼 种 可 以获 得 裉 强 的 免 疫 力 。我 们 采 用 腹 腔 注 射 攻 毒 ，水 温 从 15℃ 缓慢 升至 30℃ 并维 持一 段 时 间 ， 发 病 死 亡率 相 当低 ， 使 再 次 攻毒 ， 也 没 有 出 现 死 鱼 现 象 这 表 J在 稍 低于 临 界 温 度 的 情 况下攻毒 ，并不 要很 长时闻就能使鱼产生免疫力。 维普资讯 http://www.cqvip.com

南峰学杂志,自的0 219 virologic Silos 尾崎永雄曾指出:以海胆精子为抗原,使鲤鱼产生凝集素,28℃时7天前后可检测 出凝集素,15℃要晚4一8天()。高汉姣等的研究证实:草鱼的免疫反应更加依赖于温 度,用草鱼出血病组织疫苗免疫草鱼,水温控制在20℃以上时,免疫后第4天就能使草 鱼获得兔疫力15℃需20天,10℃騫30天,23℃-9℃时需33天才能产生免疫力0N 我们曾用血凝抑制试验检测强毒感染鱼的病毒抗体产生的时间,发现20℃恒温时出现抗 体时间为感染后第八天,而在27℃恒温时时间为第四天,可检测抗体出现的时间比发病 死亡高峰时间稍早 我们认为,在人工感染条件下,草鱼出血病的结局取决于病毒在鱼体内增殖的数量 及鱼对病毒的免疫能力。在24℃以上时,病毒增殖速度快,在鱼体免疫功能尚未发挥作 用之前,病毒在鱼体内增殖的数量足以导致鱼的死亡。在低于20℃时,病毒的增殖速度 受到抑制,部分病毒失去感染性而保留其免疫原性,尽管低温时特异性抗体产生的时间 较晚,但在病毒尚未达到鱼致死量之前就发挥了作用,由此可见,温度对草鱼出血病流 行的影响主要在控制病毒增殖速度方面。 参考文就 〔1〕中国科学院武汉病毒研究所,中国水产科学院长江水产研充所沙市分所草鱼出血病研究协作氬,1884,淡 水渔业,(4)7-9 〔2〕陈燕骗、江育林,1983,科学通报,28(9)11381140 〔3〕黄琪琰主编,1983,鱼病学,上海科学技术出版社,上海,PB0, 〔4〕中国科学院水生生物研宪所,1978,水生生物学集刊,(3),321-330 〔6〕中国科学院武汉病毒研充所,中国水产科学院长江水产研究所沙市分所草鱼出血病研究协作组,1984, 水渔业,(2)21-22 〔6〕中国医学科学院流行病防治研究所,1978,常见病毒病实验技术,科学出版杜,北京,P308, 〔7〕罗楞等,19B6,江西水产料技(1)5 〔8〕范至刚、1984,康慧,淡水渔业,(4)10-11 〔9〕尾崎久誰著,许学龙等译,1982,鱼类血液与循环生理,上海科学技术出版社,上海,P 〔10〕高汉姣等,1980,鱼病讯,(3)1一8

●拳j吨 j，I●●O V ttoloEfh $111el 21§ 尾 崎永雄 曾指 出，以海胆 精子为抗原 ，使鲤鱼产生凝 集素，28℃时 7天前 后可检测 出凝集素 ，15℃要晚 4— 8天 )。高汉姣等的研究证实 l草 鱼的免疫反 应 更加 依赖 于温 度，用草鱼 出血病 组织疫苗免疫草 鱼，术温 控制在20"G以上 时，免疫 后第 4天就能 使草 鱼获得免疫 力，I5 需 2O天 ，10℃需3O天 2．3℃一0℃时 霹33天才 能产 生党疫 力 【H]。 我们 曾用血凝抑制试验检测强毒感染鱼的病毒抗体产生的时间，发现20℃恒温时出现抗 体时间为感染后第，恹 ，而在27℃恒温时时间为第四天，可检测抗体出现的时间比发病 死亡高峰 时间稍早 。 我们认为 ，在人 工感染条件下 ，草鱼出血病的结局取决 于病毒在 鱼体 内增殖的数量 及鱼对病毒的免疫能力。在24℃以上时，病毒增殖速度快，在鱼体免疫功能尚未发挥作 用之前 ，病毒在 鱼体 内增 殖的数量 足以导致 鱼的死亡 在低于20℃ 时，病毒 的增殖速度 受到抑 制，部分 病毒失 去感 染性而保 留其 免疫原 性，尽管低温时特异性 抗体产生的 时间 较晚，但在精毒尚未达到鱼致死量之前就发挥了作用，由此可见，温度对草鱼出血病流 行 的影 响主要在控 制病毒增 殖速 度方面。 参 考 文 献 C1) 中国科学 院武 汉病毒 研究所 ，中国水产 科学 院长讧水 产研 究所曲 市分所 草鱼出 血病研 究协作 塑． 1984，淡 水 渔业 ，(4)7— 0． (2) 陈燕 建 ，江育林 ， 1988， 科学通 报，28(8)F1138- 1140． C3】 黄琪 琉主编 ，1988，鱼病 学·上海科 学 技术 出版社 ，上海 ，P80． [4) 中国科 学院 水生生 物研究 所 ·I978．水 生 生物 学集干玎， 6(3)．32l一 330． [6) 中国科学院武汉病毒研究所，中国水产科学院长江水产研究所抄市分所草鱼出血宿研究协 作 蛆，1984．淡 水渔 业，‘(2)2l一2 ． (6) 中国医学 科学 院流行 病防 治研究 所，1978．常 见病毒 瘸实验 技术， 科学出 版社 ，北 京 ，P899． [7) 罗楞 等 ．1985．江西水 产科 技(1)5． [8) 范至 刚，1984．康 慧。谈 水渔业 ．(4)1D一11． [9) 尾崎A 摧 著·许学 龙 尊译· l982，鱼类血 辛蓖与 循环生 理 ·上 海科 学拄木 出版社 ．上 海．P839 [1O) 高汉蛀 等。 10e0．鱼病 麓讯 ，(3)1— 8 维普资讯 http://www.cqvip.com