《草鱼出血病》草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究及其应用初报

●鱼病防治●鱼病防治● ●责任编辑张俊友 草鱼出血病细胞培养灭活疫苗 的研究及其应用初报 邓初夏高汉姣李燕陈宏溪陈燕新 中国科学院水生生物研究所) 摘要,试验证明:1.GCK亠84細胞培养灭活疫苗以32-35°C灭活72小时为最住条件,以10% 福尔马林使其最终浓度为0.1%为最好,室内免疫效果达963。2GCK-84细胞疫苗以02浓度 为最好,保护率达9%以上。3在10-浓度疫苗中加入佐剂,能使保护率由88%提高到842 并剪成碎块。再经洗涤2次后,按冷消化法 前言 消化和接种,接种密度100万/m1细胞。培养 草鱼出血病是鱼种阶段危害最为严重的液采用加有20%小牛血清的TC199<Di- 种病毒性鱼病,该病发病季节长,死亡率 fco Laboratory,U.S.A),内含1倍 高,流行广,严重影响淡水鱼的产量与质“三抗”,培养温度为27℃。从接种后第10 天起选择基本形成致密单层的细融进行传代 从1973年开始,我所对此病进行了防病培养,传代后,第1、2代细胞生长较为迅 免疫工作,研制出草鱼出血病病鱼组织浆灭速,但至第8代时,细胞生长甚差,大量死 活疫苗,已在全国15个省、市推广应用,免亡,仅有少量残存,此时坚持每周换液 疫效果相当稳定,取得了明显的社会效益和次,维持细胞生长。一月后,有一瓶细题开 经济效益 始生长,待其长至大半瓶时,按一分为二传 因组织浆灭活疫苗系采用病鱼组织制代,细胞生长逐步恢复正常,平均每8-4 成,疫苗效价不稳定。为了研制一种高效、天可传代一次。当传至35-40代之间时,因 安全、携带方便、便于工厂化生产的细胞培更换血清,传代后细胞易成团块,然后慢慢 养灭活疫苗,我们于1986年开展了草鱼出血铺开,生长速度变慢。40代后,再换适当的 病细胞培养灭活疫苗的实验研究,现将初步血清,细胞又进入旺盛增殖时期。目前,该 实验结果报告如下。 细胞已传至150余代,历时8年,建成细胞 系,命名为GCK-84 材料和方法 二、病毒提取及细胞毒制备 细胞培养及建系过程。 1。病毒提取 取本所试验场饲养的当年草鱼,暂养一取具典型出血病症状的草鱼肝、鼻、肾 周后,选择健康鱼种,用剪刀切断鳃动脉放组织,在冰浴中制成匀浆,加入无血清的 血,并用75%酒精进行体表消毒,在无菌条TC—199培养液稀释10倍,经300转分离 件下取出肾脏,置于加有10倍“三抗”〔青心30分钟,过滤除菌,置-70℃备用。 霉素10001U/ml、链霉素1000IU/ml、卡那 g.细胞毒制备 霉素50ug/m1)的PBS(一)液中洗涤2次 将上述病毒提取液用无血清的TC—199 《水利业》198年第6舞

● 鱼病 舫治● 鱼庸防涪● ●责 任编辑 张俊友 草鱼 出血病细胞培养灭活疫苗 的 研 究 及 其 应 用 初 报 邓 初夏 高 汉姣 李燕 陈宏溪 陈燕新 (中国科 学硫 水生生物研 究所) 摘要 。试验证嘲。1．GCK-'-84细胞培养灭活疫苗以32—35‘c灭活72小时为最隹条件，以l0啊 福 尔马林使其最终浓度为o．1啊为最好．室内免疫效果达 96．3骊．2．GCK-84细胞疫苗以tOI上浓度 为最好 ，保护率达98骊以上．3．在 lO 浓度疫苗中加入佐剜．能使保护率 由e8．8骊提高到8．2骊一 l 1oo嘶 ． 前 言 草鱼出 血病 是鱼 种阶段危害最 为严 重 的 一 种病 毒 性鱼病 ，该病 发病季节 长 ，死 亡 率 高 ，流行广 ，严重影 响淡水鱼 的 产 最 与 质 量 。 从 1973年开始 ，我所对 此病进行 了防病 免碗 工作 ，研 制 出草鱼 出血 病 病鱼 组织浆灭 活疫苗 ，已在垒 国15个省 、市推广应 用 ，免 疫效果 相 当稳 定 ，取得 了明显 的社会效 益和 经 济 效 益 。 困组织浆 灭活疫 苗系采用病 鱼 组 织 制 成，疫苗 效价不 稳定 。为 了研制一 种高效 、 安 全 、携 带 方 便 、便 于 工 厂 化 生 产 的 细 胞 培 养灭话疫苗 ，我们 于 1986年 开展 了草 鱼出血 病 细胞培养 灭活疫 苗 的实验 研究 ，现 将 初步 实 验 结 果 报 告 如 下 材 料 和 方法 一 、 细 胞 培 养 及 建 系 过 程 。 取 本所 试验 场饲 养的 当年 草鱼 ，暂养一 J背后 ，选 择 健 康 鱼 种 ，用 剪 刀 切 断 鳃 动脉 放 血 ，并 用 75 酒 精 进行 体 表 消 毒 ， 在 无 菌 条 件下取 出肾脏 ，置 于加有 10倍 “三 抗” (青 霉 素 1000lU／ral、 链 霉 素 l000IU／ml、卡 那 霉 素 50ug／m1) 的PBS (一 ) 液 中洗 涤 2 次 n‘木 ■韭 '1981年● 5■ 井剪 成碎 块 。再经 洗 涤 2次后 ，按 冷消化 法 消化 和接种 ，接 种密 度100万／ml细 胞。培养 液采 用加 有20％小牛 血靖 的TC— l99 (Di￾Ico h hot．tory．， U ． S．A) ， 内 含 1 倍 “三抗 ” ，培养 温 度为27℃。从接 种后 第1o 天起选 择基本形 成 致密 单层的细胞进 行传 代 培养 ，传代后 ，第 1、 2代 细胞生长 较为迅 速 ，但 至 第 8代时 ，纽 胞 生 长 甚 差 ，大 量 死 亡 ．仅 有少量残存 ，此时坚持 每 周 换 液 一 次 ，维持细 胞生长 。一月 后 ，有一 瓶细胞 开 始 生 长 ，待 其 长至犬 半瓶时 ，按一分 为二 传 代 ，细 胞 生 长 逐 步 恢 复 正 常 ， 平均 每 3～ 4 天 可传代一 次。 当传 至35～ 4O代之 间时，因 更 换血清 ，传代后细 胞易 成 团块 ，然后慢慢 铺 开 ，生 长 速 度 变 慢 。 4O代 后 ，再 换适 当 的 血清 ，细 胞又进 八旺盛 增殖时 期。 目前 ，该 细胞 已传 至 150余 代 ，历 时 8年 ，建 成 细 胞 系 ，命名 为GCK一 84。 二 、 病毒 提 取 及 细 胞 毒 制 备 1． 病 毒 提 取 取具典型出血病症状的草鱼肝、鼻、肾 组 织 ，在 冰 浴 中 制 成 匀 浆 ，加 八 无 血 清 的 TC～ 199培养液稀释 10倍 ，经 3000转／ 分离 心 30分 钟 ，过 滤 除 菌 ，最 一70℃备 用 。 2．细 胞 毒 制 备 将上 述病 毒提取 液用 无血清 的TC— l∞ 19 维普资讯 http://www.cqvip.com

稀释成101-10浓度,分别接种于传代24 小时左右的单层细胞中,每瓶接入1毫升。 试验与结果 吸附1小时后,用PBS(一)洗净,加人含 不同福尔马林浓度对疫苗效力的影 2%一5%小牛血清的199液,置27℃培养响 5—7天。然后将培养瓶略为摇动,用吸管取 为了选择适宜福尔马林浓度,在固定 出瓶内体(简称细胞毒),作102稀释后灭活温度(32-35℃)灭活72小时的条件 按上法感染新的细胞。另取一部分细胞毒注下,取同一批细胞毒原液,分成数份,每份 射感染1冬龄草鱼种,每尾注射0.3-0,5毫加入10%的福尔劲林,使其最终浓度为 升,将被注射的鱼及对照鱼饲养在23—26℃0,05%或0.1%。取出疫苗,经安上与效力 水桶中,连续观察15天,计算LD50。 试验,对1冬龄草鱼进行免疫试验。 有无较强的细胞毒,是能否制备高效价 结果表明,以0.1%的最终浓度较好 细胞疫苗的关键。为此,我们从1985年12月保护率达96.3%,而0.05%的最终浓度保护 至1986年6月对草鱼呼肠弧病毒在细胞中的率只有59.3% 繁殖技术进行了研究,并对各代细胞毒的毒 不同灭活温度对疫茁效力的影响 力进行了检测。结果表明:病毒在细胞内所 采用三种不同温度:32--35℃灭活72小 传代的后期,毒力较弱,随着传代数的增时,65℃灭活2小时,4一8℃灭活约一个 多,毒力逐渐增强,至第8代时LD50巳达月。结果是32—35℃灭活72小时最佳,保护 4.5。随后一段时间内,由于气温逐渐升高,率达96.3%65℃灭活2小时,其保护率只 实验室缺乏恒温设备,不利于细胞生长,毒在50%以下,而4一8℃的灭活时间太长, 力有所下降并出现一些波动,故传至15代后不可取 便停止实验。收集第5一15代细胞毒1800毫 三、疫苗浓度对出血病免疫力的影响 升,制备细胞灭括疫苗,供免疫实验用。 将疫苗稀释成10或10-梯度浓度,分 8.GCK-84细胞疫苗制备 别注射1冬龄草鱼种,规格在10cm左右, 将第5-15代细胞毒液各批混合,加每尾注射疫苗0.5毫升,饲养水温控制在27℃ 入10%福尔马林,使其最终浓度为0,1%左右,免疫15天,再以104浓度的细胞毒进 放入32一35℃水浴中灭活72小时后,取样做行攻毒,并设未经免疫的对照组,观察其免 安全和效力试验,即为细胞疫苗,保存于疫效果,结果见表1 不同事度灭活变菌的免疫效果 4.安全与效力试验 取上述细胞灭活疫苗,将原液稀释成疲菌疫菌稀度保护率(西)成活鱼款成活率 102浓度,对当年键康草鱼种进行腹腔注批号1021010-2,10-·试验鱼数() 时,每尾注射02-0.6毫升,在水温25-28℃860126/27|1/2010.310643|4/3013.3 的水缸中饲,连观察15天,没有出现出 B4D2|293022/3006,6;73.38/30.26,7 血病,证明此疫苗是安全图。另用10-1浓度 注:疫苗稀释度中数据为成活鱼数/试验鱼数 细胞毒,同时对免度与对照组按0.2—0.5毫 结果表明,疫苗稀释度为10-2时,免 升/尾进行攻毒,继续观察15天,结果对照效果在96%以上,而稀释度为103时,免疫 组发生出血病,死亡率在70%以上,病迫症效果为70%左右。由此可见,疫苗稀释度以 状与天然发病的症状一梓,而免疫组获得保10-2为宜。 护,仍健康成括,说明疫苗有效。 四、佐剂对疫苗的增效作用 水利遍业》18年篇彭期

稀释 成 10 一 10-s浓 度 ，分刖接 种 于传 代24 小 时 左 右 的 单层 细 胞 中 ，每 瓶 接 人 1毫 升 。 吸附 1小 时后 ，用PBS (一)洗 净 ，加 八台 2％一 5 小 牛血 清的199液 ，置27℃ 培 养 5— 7天 。然后将 培养瓶 略为摇动 ，用吸管取 出瓶 内液体 (简称细胞毒 )，作 lO 稀释后 按上 法感 染新 的细胞 。另取一 部分细胞毒 注 射感 染 l冬龄草 鱼 种，岳尾注射 0．3一 O．5毫 升 ， 将 被 注 射 的 鱼 及 对 照 鱼 饲 养 在 23— 26℃ 水 桶 中，连 续观察 15天 ，计算LD5o。 有 无较 强 的 细 胞 毒 ，是 能 否制 备 高 效 价 细胞疫苗 的关键 。为此 ，我 们从 1985年 l2月 至 1986年 6月 对 草 鱼 呼 肠 孤 病 毒 在细 胞 中的 繁 殖技 术进行 了研究 ，并对 各 代细胞毒 的毒 力 进 行 了检 测 。 结 果 表 明 ：病 毒 在细 胞 内所 传 代的后 期，毒 力较弱， 随着传 代 数 的 增 多 ， 毒 力 逐 渐增 强 ， 至第 8代 时LD5O巳 达 4．5。随后一段 时间 内，由于气 温 逐渐升高 ， 实验室缺乏 恒温设备 ，不 利 于细胞 生长，毒 力有所 下降并出现一 些波 动 ，故传 至 l5代 后 便 停 止 实 验 。 收 集 第 5— 15代 细胞 毒 1800毫 升 ，制备细胞灭 活疫苗 ，供免 疫实 验用。 3．GCK一 84细胞痉苗 制备 将 第 5- i5代细胞 毒液 各 批 混 台 ，加 入 1O 福尔 马林 ， 使 其 最 终 浓 度 为0．I ， 放 人 32— 35℃水 浴 中 灭 活 72小 时 后 ，取 样 做 安 全 和 效 力试 验 ， 即为 细 胞 瘙 苗 ， 保 存 于 4— 8 ℃ 。 4． 安 全 与 效 力 试 验 取 上 述细 胞 灭 活疫 苗 ，将 原 液 稀 释 成 1O 浓 赛， 对 当 年 健 康 草 鱼 种 进 行 腹 腔 注 射 ，每 尾 注 射 0．2—0．5毫 升 ，在 水 温25— 28℃ 的 水 缸 中 饲 养 ， 连 续观 察 15天 ， 没有 出 现 出 血 辅 - 证 明此 疫 苗 是 安 全 的 。 另用 10 浓 度 细胞 毒， 同时对 免疫 与对 照组按 0．2—0．5毫 升 ／ 尾 进 行 攻 毒 ， 继 续 观 察 15天 ， 结 果 对 照 组 发 生 出 血 病 ， 死 亡 率 在 70％ 以上 ， 病 鱼 症 状 与 天 然 发 病 的 症 状 一 样 ， 而 免 疫 组 获 得 保 护 ， 仍 健 康 成 活 ， 说 明 疫 苗 有 效 试 验 与结果 ． 一 、 不 同 福 尔 马林 浓 度 对 疫 苗 效 力 的影 响 为 了选 择遣宜 的福 尔 马林浓度 ，在 固定 灭 活 温 度 (32— 35℃ ) 灭 活 72小 时 的 条 件 下 ， 取 同一 批 细胞 毒 原 液 ， 分 成 数 份 ， 每 份 加 入 1O 的 福 尔 马 林 ， 使 其 最 终 浓 度 为 0．05 或 0．1 。 取 出 疫 苗 ，经 安 全 与 效 力 试验 ，对 1冬 龄草 鱼进行 免疫试验 。 结 果 表 明 ， 以0．1 的 最 终 浓 度 较 好 ， 保护 率 达 96．3 ， 而 0．05％的 最 终 浓 度 保 护 率只 有 59．3 。 二 、 不 同灭 活 温 度 对 疫 苗 效 力 的 影 响 采 用 三 种 不 同温 度 ：32— 35℃灭 活 72小 时，65℃ 活 2小 时， 4～ 8℃灭活约一 个 月 。 结 果 是 32— 35℃灭 活 72小 时 最 佳 ， 保 护 率 达 96；3％ ， 65℃灭 活 2小 时 ， 其 保 护 率 只 在 50％以下 ，而 4— 8℃的灭 活时 间太 长， 不 可 取 。 三 、疫苗 浓度对 出血病免疫 力的影 响 将 疫 苗 稀 释 成 lO 或 lO 梯 度 浓 度 ， 分 ’埚4注射 1冬龄草鱼种 ，规格在 10cm 左 右 ， 每 尾 注 射 疫 苗 0．5毫 升 ，饲 养 水 温 控 制 在 27℃ 左 右 ， 免 疫 l5天 ，再 以 l0 浓 度 的 细 胞 毒 进 行 攻 毒 ， 并 设 未 经 免 疫 的 对 照 组 ， 观察 其 免 疫 效 果 ， 结 果 见 表 1。 囊 1 不同稀释窿再活盛蓝妁免疫技果 往 ，疫 苗稀释度 中数据 为成 活盘赦／ 试验 鱼数 结 果 表 明 ， 疫 苗 稀 释 度 为 l0 时 ， 免 童 效 果 在 96 以 上 ，而 稀 释 度 为 l0 时 ， 免 疫 效 果 为 70％ 左 右 。 F甘此 可 见 ， 疫 苗 稀 释 度 以 l0 为 宜 。 四 、佐 剂 对 疫 苗 的 增 效 作 用 t水种童韭 ’l9柏●奠 5期 维普资讯 http://www.cqvip.com

为了提高疫苗的效价,在10浓度疫苗 表8、4的结果,说明GCK-84细胞培 中添加1一4种佐剂(氢氧化铝、L一精氨养灭活疫苗在生产性鱼池中,无论是对1冬 酸、谷氨酸钠、白蛋白),比较它们对细胞龄或当年的草鱼种进行注射免疫,其免疫效 疫苗效力的影响,试验结果见表2 果都与室内的免疫效果是一致的,保护率都 2各种佐剂对翻疫首的增效作用 在70%以上,疫萬性能比较稳定。 佐剂种 保护率 ②当年草鱼种注射免疫第二试验点是在 浓度氯氧化铝氯的谷氮的白蛋白( 武汉市后湖渔场。免疫池2个,各3.5和1,1 68.8 亩,共投放免疫草鱼种13000尾。对照池面 77.7 积为8亩,投放鱼种8000尾,结果见表5。 842 十 衰5武汉市后湖逸场免疫试验 10-3 100 结果表明,在108浓度的疫苗中加入佐 免疫组 剂,疫苗的保护率有明显的提高。 五、生产性鱼池试验 对照组3 3-58090 1260 1。1冬龄草鱼免疫试验 本试验进一步说明了GCK-84细胞增养 为了验证实验室内的免疫效果,198年灭活疫苗免疫效果好,而且稳定。 4月在湖北省浠水县望天湖养殖场进行室外 ③第三试验点是在湖北省黄陂县滠口 免疫试验。共设4只网箱,每只网箱20平方渔场。因为该场草鱼种太小,无法全部进行 米,投放免疫过的草鱼种500尾(规格为10免疫注射,仅注射200g,单独放在一个池 -133cm),对照网箱1只,15平方米,中观察,成活率达100%。而其它鱼池在不 投放草鱼种260尾(10-13.3cm)。当年9同程度上都发生了出血病。说明了GCK-84 月份检查,其结果见表8。 细胞疫苗可抵抗出血病。 表3宣外网曾免变食验 小结 网箱编号疫苗液度试险鱼教 1。草鱼出血病GCK-84细胞培养灭活 疫苗以32-35℃灭活72小时为最佳条件,以 611 10%的福尔马林使其最终浓度为01%为最 对照组 好,室内免疫效果达96.3%。采用4-8℃ 2,当年草鱼种注射免疫试验 灭活,需冷库,灭活时间长,不利于发展生 ①为了进一步验证室内和网箱的免疫试产。 验,1986年6月底在东西湖渔场个体户农场 2.GCK-84细胞疫苗以102浓度为最 的鱼池中进行当年草鱼免疫试验,试验池面,保护率达96.3%。 积为5.3亩,投放免疫注射草鱼种21800尾, 3,在10-3浓度疫苗中加入佐剂 对照池8亩,投放草鱼种27000,于当以2-3种最佳,能使保护率由原来的688% 年2月份检查,试验池草鱼种成活19000尾,提高到84.2%-100% 对照池成活11000尾,见表4。 4.从生产性鱼池免疫试验的结果表明 要4·东丽湖溜场个体户鱼池免变饮验 GCK-84细胞培养爽活疫苗性能稳定,免疫 ( 效果好,室内与室外的结果基本一致。但本 53兔夜组5一6 试验时间短,数据还很不全面,尚待今后继 6,7·27000}11000 续研究。 看重》198年算期

为 了提高 疫苗 的效价 ，在 10 浓度 疫苗 申 添 加 1— 4种 佐 剂 (氢 氧 化 铝 、 L一 精 氨 酸、谷氨 酸钠 、自蛋 白) ， 比较 它们对 细 胞 疫 苗 效 力 的影 响 ， 试验 结 果 见 表 2。 囊 2 各种佐剂 对蜘臆疫尊的增效掉甩 疫 苗 佐 剂 种 类 保护宰 浓 度基氧化铝】；i 答氨酿钠白蛋白 ( ) 10。t ●● ●● 一 一 68． 9 1o-， 一 一 7T． T fo-' 一 一 84+2 lO。3 十 一 100 lO‘’ 十 十 100 结 果 表 明 ， 在 10 浓 度 的 疫 苗 中加 入 佐 剂 ，疫 苗 的保 护 率 有 明 显 的提 高 。 五 、一生产性 鱼 池试 验 1． 1冬 龄 草 鱼 免 疫 试 验 为 了验证实验 室 内的免疫效果 ，l986年 4月 在湖 北省浠水 县望天瑚 养殖场进行室 外 免 疫试验 。共设 4只网箱 ， 每只 网箱20平 方 米 ，投放 免疫 过 的草 鱼种500尾 (规 格 为 lO D 13．3cm) ，对 照 网 箱 1只 ， i5平 方 米 ， 投 放草鱼 种260尾 (10一 l3．3cm) 。 当 年 9 月 份 检 查 ， 其 结 果 见 表 3。 裹 8 宣，卜嘲糟竞褒蕾验 · 2．当年草 鱼种注 射免疫 试验 ① 了进一 步验证室 内和 网箱 的免疫试 验， 1986年 6月底 在东 西湖渔场个 体户农场 的鱼池 中进行 当年 草鱼免疫 试验 ，试验池面 积为5．3亩，投 放免疫 注射草 鱼种 21800~'。 对服池 8亩，投放 草 鱼 种27000尾， 于 当 年 t2月份检 查，试 验池草鱼 种成活 I9000,~． 对照 池成活 11000尾 ，见 表 4。 ． 囊 4 东置潮囊塌个体户直池竞疫憾奠 李亩 l试验组剐 黼 誊警f譬雪亨 5．9 I免疫组 5—6． l 2|800i I9000I 87．‘ 8 对照 组 5— 6．7 27000 ： I1O00 I 40．7 表 8、 4的 结 果 ，说 明GCK一84细 胞 培 养 灭 活 疫 苗 在 生产 性鱼 池 中 ，无 论 是 对 1冬 龄 或当年韵 草 鱼种 进行 注射 免疫 ，其免疫 效 果 都与室 内的免疫 效果 是一 致的，保护 率都 在 70％以上 ，疫苗性能 比较稳定 。 ② 当年草鱼 种注射免 疫 第二 试验点是在 武 汉市后 湖渔场 。免疫池 2个，各 3．5和 1．1 亩 ，共投 放 免疫草鱼种 13000尾 。对 照 池面 积为 8亩，投放 鱼种8000尾 ，结果见 表 5。 裹 5 豉设市后潮撞埔竞疫试验 试验组 别 水 面 鱼种规 格}试验 盘最 出 培数 成活卑 (亩 ) (cm ) (尾 ) (尾 ) (嘶 ) 免 疫蛆 0．5 5— 6 9000 8700 96． 6 I．1 4000 3880 口2 对 脯组 3 3— 5 |250 I5．6 本试验进 一步说 明了GCK一84细 胞培养 灭 活 疫 苗 免 疫 效果 好 ， 而 且 稳 定 。 ③ 第三试 验点 是在湖北 省黄 陂 县 滠 口 渔场 。 因为 该场 草鱼 种太小 ，无法全 部进行 免 疫注射，仅 注射2ooo~，单 独放在一个 池 中观 察 ，成活 率达100％。而 其它 鱼 池在 不 同程 度上 都 发生 了 出血病。说 明了GCK一84 细 胞 疫 苗 可 抵 抗 出 血 病 。 小 结 1．草鱼 出血 病GCK一84细胞 培养灭 活 疫苗 以32—35℃灭活72tb时为最佳 条件， 以 i0 的裙 尔 马林 使 其最 终浓 度为0．I％ 为最 好 ，室 内 免 疫 效 果 达9B．3％ 。 采 用 4— 8℃ 灭 活 ， 需 冷 库 ， 灭 活 时 间 长 ， 不利 于 发 展 生 产 。 2．GCK一84细 胞 疫 苜 戗。1O一’浓 度 为 最 ， 保 护 率 达 96．3％ 。 3． 在 i0 浓 度 疫 苗 中 加 人 佐 剂 ， 以2— 3种 最 佳 ，能 使 保 护 率 由原 来 的 68．8 提 高 到84．2 一 10O％。 4．从 生 产 性 鱼 池 免 疫 试 验 的结 果 表 明 ， GcK一84细胞培养芡活疫苗性能稳定，免疫 效 果 好 ， 室 内 与室 外 的 结 果 基 本 一 致 但 本 试 验 时 间 短 ， 数 据 还 很 不 全面 ， 尚特 今 后 继 续 研 究 。 。 维普资讯 http://www.cqvip.com