维普资讯htp:/www.cqvip.com 第18卷1期 中国病毒学 18(1):82-86 2003年2月 VIROLOGICA SINICA February 200 水生呼肠孤病毒研究进展 方勤1,朱作言2 (1.中国科学院武汉病毒研究所,潮北武汉430071;2.淡水生态与生物技术国家重点实验室,中国科学院水生生物研究所,湖北 武汉430072) Advances in Aquareovirus Research FANG Qin, ZHU Zuo-yan 2 (1. Wuhan Institute of virology, Chinese Academy of sciences, Wuhan 430071, China; 2. State Key Laboratory of fre- hwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China) 关镳词:水生呼肠孤病毒;草鱼呼肠孤病毒;纹斑鲈鱼呼肠孤病毒;生物学;基因组与进化 中图分类号:S85265文献标识码:A文章编号:1003-5125(2003)01-0082-05 水生呼肠孤病毒为感染水生生物的一类呼肠孤GCHV)纳入该属,命名为草鱼呼肠孤病毒( grass 病毒。自 Meyers等1979年首次报道水生呼肠孤病 carp reovirus,GCRV)。由于水生呼肠孤病毒属至 毒的分离1,迄今已分离鉴定出40余株水生呼肠孤病今尚未建立标准血清型,目前该属亚型的划分是以 毒2。与哺乳动物呼肠孤病毒一样,水生呼肠孤病毒RNA:RNA杂交为依据进行归类的2影0ARV七个 主要通过呼吸肠道感染宿主,导致出血病及肝脏与亚型(A-G)的代表种分别是,纹斑鲈鱼呼肠孤病 胰腺疾病3,在全球范围内对水产养殖业造成了严毒SBRV( Striped bass reovirus,SBRV,A)、银大马 重威胁。水生呼肠孤病毒形态结构与呼肠孤病毒相哈鱼呼肠孤病毒( Coho salmon reovirus,CSRⅤB) 似,其基因组与轮状病毒11条基因节段的双链金体美洲鳊鱼呼肠孤病毒( Golden shiner reovirus, RNA相吻合,但在遗传与抗原性上与轮状病毒无任CSRⅤ,C)、沟鲶鱼呼肠孤病毒( Channel catfish 何相关性4。本文综述了近年来水生呼肠孤病毒的 orriss,cCRv,D)、大比目鱼呼肠孤病毒TRⅤ 研究进展。 ( Turbot reovirus,TRV,E)、马苏大麻哈鱼呼肠孤病 1水生呼肠孤病毒的分类 毒(Ch n reovirus,CSV,F)、草鱼呼肠孤 病毒GCRⅤ (Grass carp reovirus,GCRV,G) 水生呼肠孤病毒广泛寄生于不同种类的淡水或 海水中的水生动物,如鱼类和甲壳动物。有些水生2水生呼肠孤病毒生物学特性 呼肠孤病毒可引起宿主产生严重的疾病,如草鱼呼2.1病毒理化性质 肠孤病毒,而另一些分离株为从常规检测的水生动 ARV病毒粒子在负染电镜下直径约75mm, 物中分离得到,但它们能导致人工接种的实验鱼发十面体立体对称,无囊膜。病毒由双层衣壳组成即 病。水生呼肠孤病毒颗粒为二十面体对称的球形颗外衣壳和内衣壳,病毒核心约50nm。研究表明: 粒,成熟病毒直径为75nm,具有双层衣壳,无囊GCRⅤ病毒粒子对脂溶性的乙醚、氯仿不敏感,在 膜;其基因组由11条 dsRNA组成。该类病毒在pH3-10之间较为稳定。此外,该类病毒对热稳 H3-11范围内十分稳定,对氯仿与和乙醚有抗性定,在56℃钝化3min仍具有一定感染性阝。完 56。基于上述病毒特性与宿主来源,国际病毒分整的病毒粒子在CSCl密度梯度离心的标准浮力密 类委员会第五次会议决定在呼肠孤病毒科中正式新度为137/cm,沉降系数约为550S。 建水生呼肠孤病毒属( aquareovirus,ARy,并将草2.2病毒核酸蛋白特性 鱼出血病病毒( Grass carp hemorrhage virus ARV基因组由11条 dsRNA节段组成,分子量 收稿日期:2002-04-05,修回日期,2002-07-18 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170730);“淡水生态与生物技术国家重点实验室”开放课题2002FB05) 作者简介:方勤(1961-),女,湖北省籍,副研究员,博士,主要从事 dsRNa病毒的分子生物学及基因工程研究
■ 一’ 第 18卷 1期 2003年 2月 中 国 病 毒 学 VIROLOGICA SINICA 18(1)：82—86 February 2003 水 生呼肠孤病毒研究进展 方 勤 ， 朱作 言 (1．中国科学院武汉病毒研究所 ，湖北 武汉 430071；2．淡水生态与生物技术国家重点实验室 ，中国科学院水生生物研 究所，湖北 武汉 430072) Advancesin AquareovirusResearch FANGQin，ZHUZuo-yan f1．Wulum InstituteofVirology,ChineseAcademyof Sciences，Wulum 430071，China；2．StateKeyLaboratoryof Fre— shwaterEcology and Biotechnology,Instituteof Hydrobiology,ChineseAcademyof Sciences，Wuhan430072，China) 关键词 ：水生 呼肠孤病 毒 ；草鱼呼肠孤病 毒 ； 纹斑鲈鱼 呼肠孤病 毒 ； 生物学 ； 基因组与进化 中圈分类号 ：$852．65 文献标识码 ：A 文章编 号 ：1003—5125(2003)01—0o82—05 水 生 呼肠 孤病 毒 为感染 水生 生 物 的一类 呼肠 孤 病毒 。 自 Meyers等 1979年首 次 报 道水 生 呼肠 孤 病 毒的分离…．迄今已分离鉴定出 40余株水生呼肠孤病 毒【2】。与哺乳动物 呼肠孤病 毒一样 ，水 生呼肠 孤病毒 主要 通过 呼 吸肠 道感 染宿 主 ． 导致 出血病 及肝 脏 与 胰 腺疾 病…．在 全 球 范 围 内对 水 产 养 殖 业 造 成 了严 重 威胁 。水生 呼肠 孤 病毒 形 态结 构 与 呼肠 孤病 毒 相 似 ．其 基 因组与 轮状病 毒 11条基 因节 段 的双链 RNA相吻合 ．但在遗传与抗原性上与轮状病毒无任 何 相关 性 【41。本文 综 述 了近 年来 水 生 呼肠 孤 病 毒 的 研 究进 展 。 1 水 生呼肠孤 病毒 的分类 水 生 呼肠 孤 病毒 广 泛 寄生 于不 同种 类 的淡 水 或 海 水 中 的水生 动 物 ，如 鱼类 和 甲壳 动物 。有些 水 生 呼肠 孤 病 毒 可引 起宿 主产 生 严重 的疾病 ，如草 鱼 呼 肠 孤病 毒 ．而另 一些 分 离株 为从 常 规检 测 的水 生 动 物 中分离得到，但它们能导致人工接种 的实验鱼发 病 。水生 呼肠 孤 病 毒颗 粒 为二 十 面体对 称 的球形 颗 粒 ，成 熟 病 毒 直 径 为 75nm，具 有 双 层 衣 壳 ，无 囊 膜 ：其 基 因 组 由 11条 dsRNA 组 成 。该 类 病 毒 在 pH3～11范 围内 十 分稳 定 ，对 氯 仿 与 和 乙醚 有抗 性 [5,61 。 基 于 上 述 病 毒 特 性 与 宿 主 来 源 ， 国际 病 毒 分 类 委 员会 第 五 次会议 决 定在 呼肠 孤 病毒 科 中正式 新 建水 生 呼 肠 孤 病 毒属 (Aquareovirus．ARV)[1，并 将 草 鱼 出 血 病 病 毒 (Grass carp hemorrhage virus， GCHV)纳 入 该 属 ，命 名 为 草 鱼 呼 肠 孤 病 毒 (Grass carpreovirus． GCRV)。 由于 水 生 呼 肠 孤 病 毒 属 至 今 尚未 建 立标 准 血 清型 ． 目前该 属 亚 型 的划 分是 以 RNA：RNA杂交 为依 据进 行 归类 的【2．8-101。ARV七 个 亚 型 (A—G) 的代 表 种 分别 是 ，纹 斑 鲈 鱼 呼肠 孤 病 毒 SBRV (|str加edbassreovirll~，SBRV，A)、银 大 马 哈 鱼 呼肠 孤 病 毒 (c0 salmo nreovirus，CSRV，B)、 金 体 美 洲 鳊 鱼 呼 肠 孤 病 毒 fGoldenshinerreo．uirll~， CSRV，C)、沟鲶鱼呼肠孤病毒 (Channelcatfishre． ovirus， CCRV， D)、 大 比 目 鱼 呼 肠 孤 病 毒 TRV (Turbotreovirll~，TRV，E)、马苏 大麻 哈鱼 呼肠 孤 病 毒 (Chum salmo nreovirll~，CSV，n、 草 鱼 呼 肠 孤 病 毒 GCRV (Grasscarpreovirll~，GCRV，G)。 2 水 生呼肠孤 病毒 生物 学特性 2．1 病 毒 理化 性质 ARV病 毒粒 子 在 负 染 电镜 下直 径 约 75nm．二 十面 体立 体 对称 ，无囊 膜 。病 毒 由双 层 衣壳 组成 即 外 衣 壳 和 内 衣 壳 ，病 毒 核 心 约 50nm。研 究 表 明 ： GCRV病 毒粒 子 对脂 溶 性 的 乙醚 、氯仿 不 敏感 ，在 pH3～10之 间 较 为 稳 定 。 此 外 ，该 类 病 毒 对 热 稳 定 ，在 56℃钝 化 30min仍 具 有 一 定 感染 性 [5,61。 完 整 的病 毒 粒 子 在 CSCI密度 梯 度 离 心 的标 准 浮 力 密 度为 1．37g／cm3．沉 降系数 约 为 550S。 2．2 病 毒 核酸 蛋 白特 性 ARV基 因组 由 11条 dsRNA节 段组 成 ．分子 量 收稿 日期 ：2002—04—05，修 回 13期 。2002—07—18 基金项 目：国家 自然科学基金资助项 I~t(30170730)；“淡 水生态与生物技术 国家重点实 验室”开放课题(20o2FB05) 作 者简介 ：方勤(1961一)，女 ，湖北省籍 ， 副研究 员 ，博士 ，主要从事 dsRNA病毒的分子生物学及基 因工程研究 。 维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯htp/www.cqvip.com 第1期 方勤,等:水生呼肠孤病毒研究进展 范围约为04-31×10Da,对应碱基数为8004800bp,肠孤病毒除享有呼肠孤病毒科共有的生物学特性 总分子量为16×10Da。11条基因节段按其在凝胶电外,一个重要的特征是它们在敏感细胞上能产生典 泳中的迁移率大小分别命名为S1-S11。根据带型可型的CPE。以 GCrVKm为模型,从细胞水平观察到 分为三组:I组包括S1~S3,Ⅱ组为s4-S6。Ⅲ组病毒的形态发生。研究表明,GCRⅴ为典型的细 为S7~Sl1。通常采用1%的琼脂糖凝胶电泳比较不胞质内合成,这一结论为呼肠孤病毒胞内复制又添 同基因型的 dsRNA图谱,SDS一聚丙烯酰胺凝胶 直接证据。 电泳则用于分析同一基因型内不同分离株的核酸差2.4病毒血清学特性 异。 对A型代表种SBRV研究认为,水生呼肠孤 采用CsCI梯度离心,对初步提纯的CSV,病毒与红细胞凝聚反应为阴性。但早期对草鱼呼肠 csV,CRV,13p2,SBRV、GCRⅤ等病毒颗粒进孤病毒的血清学研究显示,兔抗GCRⅴ抗体与人 行纯化,在常规蛋白电泳条件下,可检测到5种主呼肠孤病毒3型(MRV-3),人轮状病毒不发生免 要结构多肽组分5.12条大分子量多肽近似值为疫交叉反应;草鱼呼肠孤病毒与人O型红血球的 128-138kDa,1条中分子量多肽为65-70kDa,2凝集实验呈弱阳性反应,表明其具有较弱的凝聚红 条小分子量多肽在31-43kDa。另外,根据病毒蛋细胞的能力叫。CCRV与其它水生呼肠孤病毒在外 白的含量与电泳条件,有些病毒可检测到2条微量层衣壳抗原结构上是否存在差异,有待进一步阐 结构多肽。早期对 GCRVE7与GCRⅤs研究认为,明。根据几株水生呼肠孤病毒(CSV,CS和 GCRⅤ有11条结构多肽,其中内层核衣壳由 VP CRV)的免疫交叉实验,发现这三株病毒虽表现出 130、VP115VP110、VP90、VP80VP36这6种多各自的血清学特性,但也显示出微弱的交叉反应; 肽组成,另外5种VP73VP67VP50、VP43、VP提示ARV各亚群或毒株间可能存在一种或多种共 27为病毒外衣壳组分。按分子量大小又将这些多同的抗原决定簇。 肽命名为VP1VP11阳.,这一结果可能与病毒蛋 白纯化处理过程中的降解等实验误差有关。通过对3病毒形态学研究 纯化的病毒进行酶联地高辛标记,证实SBRV外壳 水生呼肠孤病毒为二十面体立体对称的球形颗 蛋白具有糖基化作用叫。陈延等对GCRV武汉南粒,成熟病毒颗粒具有同轴双层衣壳,直径约70 湖株多肽进行检测,证明CCRV多肽有糖基化位点80nm。类似于呼肠孤病毒,水生呼肠孤病毒在5 ,但未见进一步研究 次对称轴位置含有钉状物突起,然而与前者不同的 2.3细胞培养与感染特性 是,水生呼肠孤病毒的颗粒表面可能缺乏类似于正 研究表明,水生呼肠孤病毒能在敏感细胞培养呼肠孤病毒1蛋白或轮状病毒VP4血凝素蛋白四 物上产生明显的致细胞病变作用(CPE)。Saml等 采用负染色电镜技术对GCR进行精细结构研 发现,SBRV能在7种哺乳动物细胞上产生明显的究的结果表明,GCR为具有5:3:2立体对称的 CPE,在温度较低时(2℃),SBRⅤ滴度明显增高;20面体球形颗粒,双层衣壳,无囊膜。成熟病毒 但在37℃时,该病毒不能致细胞病变,暗示SBRV颗粒直经约71mm,病毒核心直径约50m,内层衣 可能不是人类的病原。 McPhillips等通过胰蛋白壳上有12个钉状物突起。近年来,采用低温电镜 酶和糜蛋白酶消化SBRv时,发现消化后的病毒颗技术和计算机三维重构方法对GCRV颗粒进行了分 粒感染性明显提高,这可能是与除去了病毒粒子辨率为35A的结构分析,重构的二十面体点阵表 的表面vPη7蛋白有关,其作用机理可能与呼肠孤病明,外层衣壳表面的三角剖分数为T=13左旋对称; 毒μ1蛋白的降解作用相似。GCRV在体外细胞在每个病毒颗粒的12个5次轴位置都有一个五角星 培养中最佳增殖温度为28℃,能高效感染草鱼肾细状的密度,这种突起于表面的结构单位总数为200 胞CIK,使细胞产生典型的病理变化(CPE),形成个;计算表明每个病毒颗粒表面应包含600个蛋白 直径约2mm的空斑。对低温保存的三株GCRV质亚单位,因此每个结构单位是一个三聚体。关 生物学特性比较研究发现,在低温下(-20℃)保存于GCRV外衣壳与核心衣壳蛋白结构的高分辨率 10年的三株GCRv仍然具有感染性。37℃培养条研究,目前未见进一步的报道。 件下,GCRV仍能对CIK细胞产生致细胞病变作 对SBRv的低温冷冻电镜和三维重构研究已达 用,但对BHK等哺乳动物细胞不敏感。水生呼到23A分辨率。研究表明,SBRⅤ重构的二十面体
第 1 期 方 勤 ，等 ：水生呼肠孤病毒研究进 展 范围约为 0-4—3．1xl&Da．对应碱 基数为 800．．-4800bp． 总分子量为 16xl06Da。11条基 因节段按其 在凝胶 电 泳 中的迁移 率大小 分别 命名 为 SI~S11。根据 带 型 可 分 为 三 组 ：I组 包 括 S1一S3，II组 为 S4一S6。III组 为 S7 Sll。通 常采 用 1％的琼 脂 糖凝 胶 电泳 比较 不 同 基 因 型 的 dsRNA 图谱 ．SDS一 聚丙 烯 酰 胺 凝 胶 电泳 则 用于 分析 同～基 因型 内不 同分 离 株 的核 酸差 异 ol。 采 用 CsCI梯 度 离 心 ， 对 初 步 提 纯 的 CSV， GSV，CRV，13p2，SBRV、GCRV等病 毒 颗粒 进 行纯 化 ．在 常规 蛋 白电泳 条件 下 ，可检 测 到 5种 主 要结构 多肽组分 12]。2条大分子量多肽近似值 为 128—138kDa． 1条 中 分 子 量 多 肽 为 65—70kDa．2 条 小 分 子 量 多肽 在 3143kDa。另 外 ，根 据 病 毒 蛋 白的含 量与 电泳 条 件 ．有 些病 毒 可 检测 到 2条 微量 结 构 多 肽 。早 期 对 GCRV舯3与 GCRVs75研 究 认 为 ， GCRV有 ll条结 构多肽 ，其 中内层 核衣 壳 由 VP 130、VP115、VP 110、VP90、VP80、VP36这 6种 多 肽 组成 ．另外 5种 VP73、VP67、VP50、VP43、VP 27为病 毒 外 衣壳 组 分 。按 分 子 量 大 小 又 将 这 些 多 肽命 名 为 VP1一VPll[13．141，这一 结 果 可 能与 病 毒蛋 白纯化处理过程中的降解等实验误差有关。通过对 纯化 的病毒 进 行 酶联地 高 辛标 记 ，证实 SBRV外壳 蛋 白具有糖基化作用【”。陈延 等对 GCRVs75武汉南 湖株多肽进行检测 ，证 明 GCRV多肽有糖基化位点 [131． 但 未见 进一 步研 究 。 2．3 细 胞培 养 与感 染 特性 研 究 表 明 ．水 生 呼肠 孤病 毒 能 在敏 感 细胞 培养 物上产生明显的致 细胞病变作用 (CPE)。Samal等 发 现 ．SBRV能 在 7种 哺 乳 动 物 细胞 上 产 生 明显 的 CPE，在温度较低时 (22~C)，SBRV滴度明显增高 ； 但在 37℃时 ，该病毒不能致细胞病变 ，暗示 SBRV 可 能不 是 人 类 的病 原 【。McPhillips等 通 过 胰 蛋 白 酶 和糜 蛋 白酶 消 化 SBRV 时 ，发 现消 化后 的病 毒颗 粒 感 染 性 明显 提 高 【．这 可 能是 与 除去 了病毒 粒 子 的表面 VP7蛋 白有 关 ，其 作 用机 理 可能 与 呼肠 孤病 毒 1蛋 白的降解作 用相似【。GCRV在体 外细胞 培养 中最 佳增 殖温 度为 28℃ ，能 高效 感染 草 鱼 肾细 胞 CIK，使 细胞 产 生 典 型 的病 理 变 化 (CPE)，形成 直 径 约 2ram 的空 斑 【 。对 低 温 保 存 的 三 株 GCRV 生物学特性 比较研究发现 ，在低温下 (一20℃)保存 10年 的 三 株 GCRV仍 然 具 有 感 染 性 。37℃培 养 条 件下 ．GCRV仍能对 CIK细胞产生致 细胞病 变作 用 ．但 对 BHK 等 哺乳 动 物 细 胞 不 敏 感【埘。 水 生 呼 肠 孤 病 毒 除享 有 呼 肠 孤 病 毒科 共 有 的 生 物 学 特 性 外 ．一 个重 要 的特 征是 它 们 在敏 感细 胞 上 能产 生典 型 的 CPE。以 GCRVrn为 模 型 ，从 细 胞水 平 观察 到 病 毒 的形 态 发生 ∞。研 究 表 明 ，GCRV为 典 型 的细 胞质内合成 ，这一结论为呼肠孤病毒胞 内复制又添 一 直接 证 据 。 2．4 病 毒血 清 学 特性 对 A 型 代 表 种 SBRV研 究 认 为 ．水 生 呼 肠 孤 病 毒 与红 细胞 凝 聚反 应 为 阴性 。但 早期 对 草 鱼呼 肠 孤 病 毒 的 血 清 学 研 究 显示 ，兔 抗 GCRV 抗 体 与 人 呼 肠 孤 病 毒 3型 (MRV一3)，人 轮 状 病 毒 不 发 生 免 疫 交 叉 反 应 ；草 鱼 呼 肠 孤 病 毒 与 人 O 型红 血 球 的 凝 集实 验 呈 弱 阳性反 应 ，表 明其具 有较 弱 的凝 聚 红 细 胞 的 能 力[21】。GCRV与 其 它 水 生 呼 肠 孤病 毒 在 外 层 衣 壳 抗 原 结 构 上 是 否 存 在 差 异 ，有 待 进 一 步 阐 明 。 根 据 几 株 水 生 呼 肠 孤 病 毒 (CSV， GSV 和 CRV1的免 疫 交叉 实 验 ．发 现 这 三 株 病 毒虽 表 现 出 各 自的 血 清学 特 性 ．但 也 显示 出微 弱 的交 叉 反 应 ； 提 示 ARV各 亚 群 或 毒株 间可 能 存 在 一 种 或 多 种 共 同的抗原决定簇[51。 3 病毒 形 态学研 究 水 生 呼肠 孤 病毒 为 二十 面体 立 体对 称 的球 形 颗 粒 ．成熟 病 毒 颗粒 具 有 同轴 双 层 衣壳 ，直 径约 70— 80nm。类 似 于 呼 肠 孤 病 毒 ，水 生 呼 肠 孤 病 毒 在 5 次对称 轴 位 置含 有钉 状 物 突起 ．然 而 与前 者不 同的 是 ．水生 呼 肠孤 病 毒 的颗粒 表 面 可能 缺乏 类似 于 正 呼肠孤 病 毒 叮1蛋 白或 轮状 病毒 VP4血 凝 素蛋 白阎。 采 用 负染 色 电镜技 术对 GCRV进行 精 细结 构研 究 的结果 表 明 ，GCRV为 具 有 5：3：2立体 对 称 的 20面 体 球 形 颗 粒 ，双 层 衣 壳 ，无囊 膜 。 成 熟 病 毒 颗 粒 直经 约 71nm．病 毒 核 心直 径 约 50nm．内层 衣 壳 上 有 12个 钉 状 物 突起 。近 年 来 ，采 用 低 温 电镜 技 术 和计算 机 三维 重构 方法 对 GCRV颗 粒 进行 了分 辨 率为 35h的结 构分析 ．重 构的二 十面体点 阵表 明 ．外 层 衣壳 表 面的三 角 剖分 数 为 T_13左 旋对 称 ； 在每个 病毒颗 粒 的 12个 5次轴位 置都 有一个 五角 星 状 的密 度 ，这 种 突 起于 表 面 的结 构 单位 总 数 为 200 个 ：计 算 表 明每 个病 毒颗 粒 表 面应 包含 600个 蛋 白 质亚 单位 ，因此 每个 结 构单 位 是一 个 三 聚体 [231。关 于 GCRV外 衣 壳 与 核 心 衣 壳 蛋 白结 构 的高 分 辨 率 研 究 ． 目前 未见 进一 步 的报 道 。 对 SBRV的低温冷冻电镜和三维重构研究已达 到 23A分辨率 。研究表明 ．SBRV重构的二十面体 维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯htp:/www.cqvip.com 中国病毒学 第18卷 点阵外层衣壳的三角剖分数为非完全的T=13对称(A)尾序列特征。由于该病毒RNA结构的特殊性 (左旋)。外层衣壳近100A厚,围绕着直径为600A构建未知序列的呼肠孤病毒全长节段的cDNA文 的核壳。SBRⅤ核壳蛋白为T=l的对称结构,其核库,一直以来成为该基因文库构建的难题。在 壳上的钉状物突起类似于正呼肠孤病毒λ2蛋白, GCRV RNA CDNA文库构建方面,L等采用随机 贯穿于5次对称轴附近通道。核壳上有120个亚单引物逆转录合成cDNA方法,通过PCR扩增得到 位,排列成二聚物,每一个亚单位与外壳上的600 GCHV株第6,9节段部分序列网。在国际同类研 个亚单位中的2个相作用。这一结构与呼肠孤病毒究中, Lambden等采用T4RNA连接酶将合成的带 中间亚病毒颗粒十分相似。推测水生呼肠孤病毒有N基的引物与 dsRNA3末端相连接,由此发展 BR在结构上与哺乳动物呼肠孤病毒具有很近的了单引物RT-PCR扩增法。在GCRⅤcDNA文库 亲缘关系。最新的研究发现,胰蛋白酶消化可引起构建与基因序列研究方面,我国近年来有了很大的 水生呼肠孤病毒构象发生变化,这种作用可直接影突破。釆用末端加尾法,成功扩增出GCRV全长 响病毒颗粒的转录酶活性网。 cDNA,并获得了大于3.5KB的全长cDNA克隆, 4病毒的分子生物学研究 这一历史性的突破,无疑为GCRV基因结构与功能 研究奠定了坚实的理论基础。此外,采用随机引物 1体内与体外转录 引导的TR-RCR与末端加尾部分扩增相结合的方 GCR体外转录和体内转录实验均已证明病毒法,也是获得长基因节段全长序列的有效方法凹。 核心含有内源性RNA聚合酶活性凹,最适的酶活温4.4基因序列结构与系统进化分析 度为28℃。在体外条件下,双链RNA各节短是全 GCRV为水生呼肠孤病毒属第一个完成全基因 长转录,其转录量与各节段长度成反比。草鱼呼组序列分析的毒株。基于其基因序列与GSRV的 肠孤病毒基因组的体内转录实验结果表明,病毒基比较结果,GCRⅤ应归属于水生呼肠孤病毒属C亚 因组的转录活动在病毒感染4h后开始,由早期基群。GCRV含有特有的末端保守序列5 GUUAUU 因所转录,8-10h获得晚期基因的转录产物四。 …CAUC3’。在末端序列附近,各基因节段持 4.2病毒多肽与基因定位 有特异的倒转重复序列。研究发现,3'末端核苷酸 釆用兔网织红细胞体外翻译进行SBRV与序列与最先报道的 SBRV SI、Sl1基因序列的3 GCRⅴ病毒多肽与基因定位研究表明,SBRⅤ与末端序列相同;与近期在 Gen Bank公布的大麻哈 GCRV的编码蛋白有12个组分。通过对SBR感鱼呼肠孤病毒CSv)1l节段的3末端序列也一致 染的CHSE细胞裂解液的恣同位素标记实验证明,(未见文献报道)。此外,这些3末端序列与哺乳动 其中有7个结构蛋白和5个非结构蛋白叫。七种物呼肠孤病毒完全一致。 GCRV L2基因编码的 结构蛋白及它们的分子量分别为VP1(130kDa)、RNA聚合酶VP氨基酸序列的同源性分析表明 P2(127kDa)、VP3(126kDa)、VP4(73kDa)、VP5GCRⅤ与大麻哈鱼呼肠孤病毒(CSV)及正呼肠孤 (7kDa)、VP6(46kDa)和P7(35kDa) 病毒3个血清型的RNA聚合酶序列的同源性分别 GCRV共编码12种蛋白,Sl1节段编码的2为53%与41%,而与其它属的聚合酶同源性在 种分子量分别为29kDa和19.5kDa的非结构蛋10%以下,表明GCRV与正呼肠孤病毒具有很近的 白,提示S1l可能有2个翻译起始位点叫。另外,亲缘关系(图1)。对SBRⅤ的三维结构研究,从另 对SBRv的外壳蛋白ⅤP7的理化处理结果表明, 个侧面证实了水生呼肠孤病毒与正呼肠孤病毒的 NSl5为NS29蛋白的截断形式。说明NSl5与NS29形态学相似性。此外,通过GCRV的基因序列研 共享一个编码框,只是翻译起始位点不同而已 究,首次发现该病毒基因组外存在缺损性干扰颗粒 Subramanian等对 SBRVSI节段的序列分析发现,的病毒亚基因组成分圆。 Sll节段长780bp,编码两个非结构多肽NS2l与 Ns5,共用一个终止密码子,这是S1l节段编码两5小结 种蛋白的又一证据。 草鱼呼肠孤病毒是中国分离鉴定的第一株鱼 4.3病毒基因结构与文库构建策略 类病毒6.列,是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的 与呼肠孤病毒科其它病毒一样,ARⅤ基因组毒株。草鱼出血病引起草鱼大批死亡,曾一度给 dsrna节段具有5’末端帽子结构及3’末端无Poly我国淡水养殖业造成严重的危害,故探讨该病毒的
中 国 病 毒 学 第 18卷 点 阵外 层 衣壳 的三 角 剖 分数 为非 完 全 的 T=13对 称 (左旋 )。 外层 衣壳 近 lOOA厚 ， 围绕 着 直径 为 600h 的核 壳 。SBRV核壳 蛋 白为 T=I的对 称结 构 ，其 核 壳 上 的 钉 状 物 突 起 类 似 于 正 呼 肠 孤 病 毒 2蛋 白 。 贯穿 于 5次对 称 轴 附近通 道 。 核壳 上有 120个 亚 单 位 。排 列成 二 聚物 ，每 一个 亚 单位 与外 壳 上 的 600 个 亚 单位 中的 2个相 作用 。这 一结 构 与 呼肠孤 病 毒 中 间 亚 病 毒 颗 粒 十分 相 似 。 推 测 水 生 呼 肠 孤 病 毒 SBRV在 结构 上 与 哺乳 动 物 呼肠 孤 病 毒具 有 很 近 的 亲缘 关 系 。最 新 的研 究 发现 ，胰 蛋 白酶 消化 可 引起 水生 呼肠 孤病 毒 构象 发 生变 化 ，这种 作用 可 直接 影 响病 毒颗 粒 的转 录 酶活性 [241。 4 病毒 的分子 生物 学研 究 4．1 体 内与体 外 转录 GCRV体外转录和体 内转录实验均 已证 明病毒 核心含 有 内源性 RNA 聚合酶 活性[251。最适 的酶活 温 度为 28℃。在体外条件下 ，双链 RNA各节短是全 长转 录 ，其 转 录 量 与各 节段 长 度 成 反 比[261。草 鱼 呼 肠孤 病毒 基 因组 的体 内转 录实 验结 果 表 明 ，病毒 基 因组 的转 录 活 动在 病 毒 感 染 4h后 开 始 ， 由早 期 基 因所 转 录 ，8一l0h获得 晚期 基 因 的转 录产 物[271。 4．2 病 毒 多肽 与 基 因定 位 采 用 兔 网 织 红 细 胞 体 外 翻 译 进 行 SBRV 与 GCRV 病 毒 多 肽 与 基 因 定 位 研 究 表 明 ．SBRV 与 GCRV的编码蛋 白有 l2个组分 。通过对 SBRV感 染 的 CHSE细胞 裂 解 液 的 同位 素标 记 实 验证 明 ． 其 中有 7个 结 构 蛋 白和 5个 非 结 构 蛋 白 [iq。七 种 结 构 蛋 白 及 它 们 的 分 子 量 分 别 为 VPl(130kDa)、 VP2 (127kDa)、VP3(126kDa)、VP4 (73kDa)、VP5 (7lkDa)、VP6 (46kDa)和 VP7 (35kDa)。 GCRV~3共编 码 l2种 蛋 白 ．Sll节 段 编 码 的 2 种 分 子 量 分 别 为 29kDa和 l9．5kDa的 非 结 构 蛋 白 ，提示 Sll可 能有 2个 翻译 起 始 位 点【I41。另 外 ， 对 SBRV 的外 壳 蛋 白 VP7的 理 化 处 理 结 果 表 明 ． NSI5为 NS29蛋 白的截 断 形式 。说 明 NSI5与 NS29 共 享 一个 编 码 框 ， 只是 翻 译 起 始 位 点 不 同 而 已[iq。 Subramanian等 对 SBRVS1l节 段 的 序 列 分 析 发 现 ， Sll节 段 长 780bp，编 码 两 个 非 结 构 多 肽 NS21与 NSI5，共 用一 个 终止 密码 子 ，这是 Sll节 段编 码 两 种 蛋 白的 又一证 据 。 4．3 病 毒基 因结构 与 文库构 建 策 略 与 呼肠 孤 病 毒 科 其 它 病 毒 一 样 ，ARV 基 因 组 dsRNA节 段 具 有 5’末端 帽 子 结 构及 3’末 端 无 Poly (A)尾 序 列特 征 。由 于该 病 毒 RNA结 构 的特殊 性 ， 构 建 未 知 序 列 的呼 肠 孤 病 毒 全 长 节 段 的 cDNA 文 库 ．一 直 以 来 成 为 该 基 因 文 库 构 建 的 难 题 。 在 GCRV RNA cDNA 文 库 构 建 方 面 。Li等 采 用 随 机 引 物 逆 转 录 合 成 cDNA 方 法 。通 过 PCR 扩 增 得 到 GCHVs6；株第 6，9节段部分序列 。在 国际同类研 究 中 ．Lambden等 采 用 T4RNA 连 接 酶 将 合 成 的 带 有 N 基 的 引 物 与 dsRNA3’末 端 相 连 接 ，由此 发 展 了单 引物 RT—PCR扩增 法 [3o1。在 GCRV cDNA文 库 构建 与 基 因序 列 研 究方 面 。我 国近年来 有 了很 大 的 突 破 。 采 用 末 端 加 尾 法 ，成 功 扩 增 出 GCRV 全 长 cDNA，并 获得 了大 于 3．5KB 的全 长 cDNA 克 隆【31， 这一 历史 性 的突 破 。无疑 为 GCRV基 因结 构 与 功能 研究 奠 定 了坚 实 的理论 基 础 。此 外 ，采用 随机 引物 引 导 的 TR—RCR 与末 端 加 尾 部 分 扩 增 相 结 合 的方 法 。也 是获得 长基 因节段 全长序 列 的有 效方法1321。 4．4 基 因序 列结 构 与 系统 进化 分 析 GCRV为水生呼肠孤病毒属第一个完成全基 因 组序列分析 的毒株D2JT]。基 于其基 因序 列与 GSRV 的 比较 结 果 ，GCRV应 归 属 于水 生 呼肠 孤 病 毒 属 C亚 群[371。GCRV含有 特 有 的末 端保 守 序 列 5’GUUAUU … … … CAUC3’。在 末 端 序 列 附 近 。各 基 因节 段 持 有特 异 的倒 转 重 复序 列 。研究 发 现 。3’末 端 核苷 酸 序 列 与 最 先 报 道 的 SBRV S10、S1l基 因序 列 的 3’ 末 端 序 列 相 同 ；与 近 期 在 GenBank公 布 的 大 麻 哈 鱼 呼肠 孤 病 毒 fCSV)ll节 段 的 3’末 端 序 列 也一 致 (未 见文 献 报道 )。此 外 ，这 些 3’末端 序 列 与 哺乳 动 物 呼 肠 孤 病 毒 完 全 一 致 。 GCRV L2基 因 编 码 的 RNA 聚合 酶 VP2氨 基 酸 序 列 的 同 源 性 分 析 表 明 ． GCRV 与 大 麻 哈 鱼 呼肠 孤 病 毒 (CSV)及 正 呼 肠 孤 病 毒 3个 血 清 型 的 RNA 聚合 酶序 列 的 同源 性 分 别 为 53％ 与 4l％ ， 而 与 其 它 属 的 聚 合 酶 同 源 性 在 lO％以下 ，表 明 GCRV 与正 呼肠 孤病 毒 具 有很 近的 亲缘 关 系 (图 1)。对 SBRV 的三 维 结 构 研究 ，从 另 一 个 侧 面证 实 了水 生 呼肠孤 病 毒 与正 呼肠 孤 病毒 的 形 态 学 相 似 性 。此 外 ，通 过 GCRV 的 基 因序 列 研 究 ，首次发现该病毒基 因组外存在缺损性干扰颗粒 的病 毒 亚基 因组 成 分[381。 5 小 结 草 鱼 呼肠 孤 病 毒 是 中 国分 离 鉴 定 的 第 一 株 鱼 类 病 毒 【6．剪1，是 水 生 呼 肠 孤 病 毒 属 中致 病 力 最 强 的 毒株 【2】。草 鱼 出血 病 引 起 草鱼 大 批 死 亡 ，曾一 度 给 我 国淡 水 养殖 业 造成 严重 的危害 ，故 探 讨该病 毒 的 维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯htp:/www.cqvip.com 方勤,等:水生呼肠孤病毒研究进展 ovinus using RNA-RNA blot hybridization [J]. Virology, 1993 197:475-4 三能 new genogroup of aquareovirus by RNA-RNA hybridization J Gen Virol,1997,78:1385-13880. [10] Mertens PP C, Arella M, Attoui H, et al. Reoviridae Vinus Taxonomy. Seventh Report of the Intemational Committee 350300250200150100500 for the Taxonomy of Viruses[M]. San Diego: Academic Pres Nucelotide Substitutions(x100) 图111种呼肠孤病毒系统发育进化树 [Il] Subramanian K, McPhillips T H, Samal S K, Characterization of the polypeptides and determination of genome coding assignmen Fig 1 Phylogenetic tree for the 11 members of family Reoviridae of an aquareovirus [J]. Virology, 1994, 205(1): 75-81 GCRⅤ( Grass carp reovirus,草鱼呼肠孤病毒);Csv( Chum salmon 「12]方勤,肖调义,丁清泉,等.草鱼呼肠孤病毒991分离株的 virus,大麻哈鱼呼肠孤病毒);MRⅤ( Mammalian reovirus,哺乳动物 病毒学特性分析卩中国病毒学,2002,17(2),183 肠孤病毒);CTFv( Coronado tick fewer virus,罗拉多婢传热症病 [3陈延,王炜,柯丽华,等.草鱼出血病病毒的糖蛋白和结构 毒);RRSⅤ( Rice ragged stunt virus,水稻病毒);NRv( Nilaparvata lugens reovirus,裴济病毒);BoRv( Bovine rovings,牛轮状病毒); [14】王炜,蔡宜权,方勤,等.草鱼出血病病毒多肽的基因定 RDv( Rice dwarf rirus水稻矮编病毒);BAv( Banna virus,东南亚 位门中国病毒学,1994,9(4:356-361 12条基因组RNA病毒);AHSⅤ( African horse sickness virus,非 [15] Samal SK hillis TH, Dinan D, et al. Lack of restriction 马病病毒);BTv( Bluetongue virus,兰舌病毒) of growth for aquareovirus in mammalian cells [ J). Arch Vi- 侵染与复制机理,是亟待解决的研究课题。此外 rol,1998,l43③3):571-579 GCRV为中国在国际上首次完成全基因序列分析的6 McPhillips T H, Dinan D, Subramamian K,eta. Enhanc of aquareovirus infectivity by treatment with protease: mechanism 第一株水生呼肠孤病毒,是迄今研究得最系统深入 of action[ I Virol,1998,72(4):3387-3389 的水生呼肠孤病毒;以GCRⅤ为模型继续进行水(17] Knipe D M, Howley P M. Fields Virology [M. Philadelphia: 生呼肠孤病毒的分子致病机理与开展抗病毒等相关 Lippincott Williams and wilkins, 2001, 1679-1728 研究,将在理论与实践上产生十分深远的意义。 18」方勤,柯丽华,蔡宜权.草鱼出血病病毒的生长特性及高滴 价培养病毒学杂志,1989,4(3):315-319 参考文献 19]方勤,肖调义,邹桂平, 株草鱼呼肠孤病毒毒株的感 染特性比较研究门中国病毒学,2002,17(1),188-190 [11 Meyers T R. A Reo-like virus isolated from juvenile American 20]邹桂平,方勤草鱼呼肠孤病毒在CIK细胞中复制及形态发 oysters( Crassostrea virginica)[J) J Gen Virol, 1979, 43: 203 生的研究中国病毒学,2000,15(2),186-192 [2] Rangel A A, Lockemann DD, Hetrick F M,eal. Identific.[21柯丽华,方勤,余兰芬,等.草鱼出血病病毒的血清学鉴定 病毒学杂志,19915(3):252-255 tion of grass carp haemorrhage virus as a new enogroup of [22] Shaw A L, Samal S K, Subramanian K. The structure of aqu aquareovirus). J Gen Virol, 1999, [31 Ahne W. viral infectious of aquatic animals with pecial refer- eovir us shows how the different geometries of the two layers of ence to asiana quaculture [J] Ann Rev Fish Dis, 1994. 4: 375 and stabilization [JI. Structure, 1996, 4(8): 957-96 [23]徐伟,张兴,柯丽华,等,草鱼出血病病毒的低温电镜技术 和三维重构电子显微学报,1998,17(4):325-326. [24] Nason E L, Samal 5 K. Prasad BVV. Trypsin induced Struc tural Transformation in quareovinus [J J virol, 2000, 74: 6546- [5] Winton J R, Lannan C N, Fryer J L, et al. Morphological and 6555 oviruses isolated from aquatic animals [h J Gen Virol, 1987.68 「25]黄捷,柯丽华,蔡宜权,草鱼出血病病毒的RNA转录酶活性 研究病毒学报,1992,8(1):50-56 (2):353-356 6]柯丽华,方勤,蔡宜权.一株新的草鱼出血病病毒分离物的 [26]黄捷,柯丽华,蔡宜权.草鱼出血病病毒反应核心的研究卩 生物化学与生物物理学报,1992,24(2):132-139 特性水生生物学报,1990,14(2):153-159 [7 Francki R I B, Fanquet C M, Knudson D L. et al. Classifica- 27]张保焰,柯丽华,草鱼出血病病毒基因组体内转录的研究 tion and nomen laure of viruses: Fifth Report of the Intema- (28) Subramanian K. Samal S K. Cloning and sequence analysis of es J. Arch Virol, I a non-structural gene of an aquareovirus J). Virus Genes, 1997 Supp),2:186-19 15(1):83-86 oiani B, Hetrick FM, Samal S K. Genetic analysis of aquare-
第 1 期 方 勤 ，等 ：水 生呼肠孤病毒研究进展 85 GCRV： CSV2 -ⅡlV一3 CTFV— RRSVNLRVBORV— RDV—C BAV—In AHSR— BTV-2 350 300 250 200 150 100 50 0 NucelotideSubstitutions(~100) 罔 l l1种呼肠孤病 毒系统发育进化树 Fig．1 Phylogenetictreeforthe llmembersoffamily Reoviridae GCRV(Grasscarpreovirus，草鱼呼肠孤病 毒)；CSV(Chums02monre— ovirus，大麻 哈鱼呼肠孤病毒 )；MRV(Mamm02／anreovirus，哺乳动物 呼肠孤病 毒 )； CTFV(Cororadotickrevervirus，罗拉 多婢 传热 症病 毒)；RRSV(Riceraggedstuntvirus，水稻病 毒)；NLRV(Nilaparvata lugensreovirll~，裴 济病毒 )； BoRV(Bovinerotovirus，牛轮状 病毒 )； RDV(Rice virus水 稻 矮缩病 毒 )； BAV(Bannavirus，东南 亚 12条基因组 RNA病毒 )： AHSV(Aria&anhorsesicknessvirus，非洲 马病病毒 )；BTV(Bluetonguevirus，兰舌病毒 )． 侵 染 与复 制 机 理 ，是 亟待 解 决 的 研 究课 题 。此 外 ， GCRV 为 中国 在 国际 上首 次 完成 全 基 因序 列 分 析 的 第 一株 水 生呼 肠 孤病 毒 ．是 迄今 研 究得 最 系统 深 入 的 水 生 呼 肠 孤 病 毒 ： 以 GCRV 为 模 型 继 续 进 行 水 生 呼肠 孤病 毒 的 分子 致病 机 理 与开 展抗 病毒 等 相关 研 究 ．将 在理 论 与实 践 上产 生 十分 深远 的 意义 。 参 考文献 Meyers T R．A Reo—likevirusisolatedfrom juvenileAmerican oysters(Crassostreavirginica)fJ】．JGenViral，1979，43：203- 2l2． RangelA A ，Rockemann D D，HetrickF M ，et Identifica— tion of grass carp haemorrhage viru s as a new enogroup of aquareovirus[J]．JGenViro}．1999，80：2399-2402． Ahne W ．Viralinfectiousofaquatic animalswith psecialrefer· encetoasianaquacufturefJ】．AnnRevFishDis，1994，4：375— 388． Samal S K ．DopazoC P。McPhillipsT H． et ．Molecularchar acterization of a rotaviruslike viru s isolated from striped bass (Moronesaxatilis)fJ】．J Viml，1990，64(11)：5235-40． WintonJR，LannanC N，FryerJL，et ．Morphological and biochemical properties offour membersofa novelgroup ofre· ()virusesisolatedfrom aquaticanimals[J1．JGenVirol，1987，68 (2)：353-356． 柯 丽华 ，方 勤 ，蔡 宜权．一株新的草 鱼出血病病毒分 离物的 特性 fJ】．水生生物学 报 ，1990，14(2)：153—159． FranckiR IB，FanquetC M ，Knudson D L，et ．Classifica· tion and nomenclature ofviru ses： Fifth Reportofthe Interu a． tional CommitteeonTaxonomyofViruses【JJ． ArchVirol，1991 (Supp1)，2：186-192． Luoiani B，HetrickF M ，Samal SK ．Geneticanalysisofaquarc~ [9】 [1O】 [12】 [13】 [14】 【15】 [16】 [17】 [18】 [19】 [20】 [21】 [22】 [23】 [24】 [25】 [26】 【27】 [28】 ovirususing RNA—RNA blothybridizationfJJ．Vimlogy，1993． 197：475-479． Subram anian K， Hetrick F M ， SamalS K． Identification ofa newgenogroupofaquareovlrusbyRNA—RNAhybridization [J】． JGenVirol，1997．78：1385—13880． MertensP P C． Arella M ， AttouiH ，et ．Reoviridae．In： Viru sTax onomy． Seventh Report ofthe International Committee fortheTaxonomyofViruses[M]． SanDiego：AcademicPress， 20o0． SubramanianK．McPhillipsT H ，Samal S K，Characteriza tionof thepo lypeptidesand determinationofgenomecodingas signments ofanaquareovirus【J1．Virology，1994，205(1)：75—81． 方 勤 ，肖调义 ．丁清泉 ，等．草鱼呼肠 孤病毒 991分离株 的 病毒学 特性分 析 [J1．中国病毒学 ，2002，17(2)，183-187． 陈 延 ．王 炜 。柯丽华 ，等．草鱼出血病病毒的糖蛋 白和结 构 多肽 的抗 原性 『J1．病毒学报 ，1992，8(1)：57—61． 王 炜 ．蔡 宜权 。方 勤 ，等． 草鱼出 血病病毒 多肽的基 因定 位 fJ1．中国病毒学 ，1994，9(4)：356—361． Samal S K ．McPhillipsT H ，Dinan1／，et ．Lack ofrestriction ofgrowth for aquareovirus in mammaliancells[J1．ArchVi· m1．1998，143(3)：571—579． McPhillipsT H ．Dinan D ．Subramamian K，et Enhancement ofaquareovirusinfectivityby treatmentwith protease：mec hanism ofaction【J1．JVirol，1998，72(4)：3387—3389． KnipeD M，HoMeyP M． FieldsVimlogy[MI．Philadelphia： Lippincott W illiams and W ilkins，2001，1679—1728． 方 勤 ，柯 丽华 ．蔡宜权 ．草鱼出血病 病毒 的生长特性及 高滴 价培养 fJ】．病 毒学 杂志 ，1989，4(3)：315-319． 方 勤 ．肖调义 ．邹桂平 ，等．四株草 鱼呼肠孤 病毒毒株 的感 染特性 比较研究 [J1．中国病毒学 ，2002，17(1)，188—190． 邹桂平 ，方 勤．草鱼呼肠孤病 毒在 CIK细胞中 复制及形 态发 生的研究 [J1．中国病 毒学 ，2000，15(2)，186-192． 柯 丽华 ，方 勤 ．余兰芬 ，等．草鱼 出血病病 毒 的血清学鉴 定 [J1．病毒学杂志．1991，5(3)：252-255． Shaw A L，Samal S K， Subramanian K．1’he stru cture ofaqu～ Ri'eovirusshowshow thediferentgeometriesofthe twolayersof the capsids are reconciled to provide symmetrical interactions andst8bilization[JJ．Structure，1996，4(8)：957-967． 徐 伟 ，张 兴 ．柯 丽华，等．草鱼 出血病 病毒的低温 电镜 技术 和三维重构 [J】．电子显 微学报 ，1998，17(4)：325—326． Nason E L，Samal S K，Prasad BVV．Trypsin induced Stru c· tural Transformationinquareovirus[J1．JVirol，2000．74：6546～ 6555． 黄 捷 ，柯丽华 。蔡宜权．草鱼 出血病病毒 的 RNA转 录酶活性 研 究 ．病毒学报 ，1992，8(1)：50-56． 黄 捷 ，柯丽华 ，蔡宜权．草鱼 出血病病毒反应核心 的研究 fJ1． 生物化学与生物物理学报 ，1992，24(2)：132—139． 张保焰 ，柯 丽华．草 鱼出血病病 毒基 因组 体 内转 录的研 究 【J】． 中国病毒学 ，1993，8f2)：185—188． Subramanian K，Sam al S K．Cloning and sequence an alysis of anon—structural geneofaIlaquareovirus【J】．VirusGe nes，1997， 15 f11：83—86． … 维普资讯 http://www.cqvip.com
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