《草鱼出血病》草鱼出血病病毒减毒的研究

第7卷第3期 上海水产大学学报 Vol.7,No.3 1998年9月 JOURNAL OF SHANGHAI FISHERIES UNIVERSITY Sep.1998 21-2 94,411 草鱼出血病病毒减毒的研究 许淑英李焕林邓国成姜兰白岳强 (中国水产科学研究院珠江水产研究所,广州510380 摘要草鱼出血病病毒GCHV-892野毒株在PSF细胞连续传代过程,于培养液中加入一 定浓度的按液,传至19代已达减毒目的。继续传至29代其减毒效果保持稳定27代后不再加入按 液,继续传至37代其减毒效果仍然保持稳定不变。致弱病毒对草鱼的安全性好免疫原性强用该 弱毒株制备的弱毒疫苗免疫草鱼后,草鱼的成活率和免疫保护率均达100%表明液是草鱼出血 病病毒的一种良好减毒剂。经按液减毒的GCHA-892是一株良好的减毒株。 关键词草鱼出血病病毒,液减毒 中国分类号 S94 草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国传统的优质养殖鱼类养殖面积广但其鱼种阶段 易受出血病危害,成活率低。草鱼出血病是一种病毒性疾病,免疫预防是该病最有效的防治方 法。作者对草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗进行了多年的研究,现已成功地研制出免疫效果良好 的弱毒疫苗[许淑英等1994]弱毒疫苗的研制关键是要将强毒株进行减毒,最后筛选出安全 性好、免疫原性强的弱毒株。弱毒株可以通过不同途径和方法获得[章以浩等1966, Kisary 1978]几年来,作者对草鱼出血病病毒株进行了减毒研究现将结果综合报道如下。 1材料和方法 1.1病毒 具有强毒力的GCHV-892野毒株(下称892株来源于珠江三角洲池塘出现典型病症的草 鱼肝、脾、肾组织,取样后作如下处理:剪碎、浆后用不含小牛血清的199培养液稀释10倍, 置冰箱4℃预冷用10000m离心20分钟,上清液即为除菌组织病毒液经无菌检验后即可用 于本试验。 1.2细胞 由本所建立的草鱼吻端成纤维细胞系PSF是对草鱼出血病病毒敏感的细胞系(李焕林等 1988)将细胞培养于含10%小牛血清的199养液(日本产培养基中待细胞长成致密单层后 1998-06-01收到 (1)李焕林,许英邓国成等,198.草鱼吻端成纤维细胞系PSF的建立及其生物学特性,中国水产科学研究院学报, (1):1~8

第 7卷第 3期 1998年 9月 上 海 水 产 大 学 学 报 JOURNAL OF SHANG HAIFISH ERIES U NIVERSITY Vo1．7． No．3 sep．t1998 三 {}一 草鱼出血病病毒减毒的研究 L许— — —淑— — 英一 李— — 焕— — — 一 邓国成 姜 兰 白岳强 (中国水 产科 学研 究 院珠江 水 产研 究所 t广州 510380) 摘 要 草 鱼 出血病 病毒 GCHV一892野 毒株 在 PSF细胞 连 续 传代过 程 ，于 培养 液 中 加入 一 定 浓度 的桉 液 ．传 至 l9代 已选 减 毒 目的 。继 续 传 至 29代其 减 毒 效 果保 持 稳 定 。27代 后 不 再 加 入桉 液，继续传至37代其减毒效果仍然保持稳定不变。致弱病毒对草 鱼的安全性好+免疫原性强 。用该 弱毒 株制 备 的弱毒 疫苗 免 疫草 鱼 后 ，草 鱼 的成 活率 和 免疫 保 护率 均选 100％ 。表 明桉液 是 草 鱼 出血 病痛 毒 的一种 良好 减毒 剂 。经按 液 减毒 的 GCHAV一892是 一株 良好 的减 毒 株 。 关键 调 草 鱼 ，出血病病 毒 ，柱 液 ，减 毒 中 圈分 类号 $94 草 鱼(Ctenopharyngodonidella)是 我 国传 统的优质养 殖鱼类 ，养 殖面积 广 。但其 鱼种 阶段 易受出血病危 害 ，成 活率低 。草鱼 出血病是 一种病毒性疾 病 ，免疫预 防是该病 最有效 的 防治 方 法 。作者对草鱼 出血病 细胞培养弱毒 疫苗进行 了多年 的研 究 ，现 己成功地研制 出免 疫效 果 良好 的弱毒疫苗[许 淑英 等 1994]弱毒疫 苗的研 制关键 是要 将强毒 株进行 减 毒 ，最 后筛选 出安 全 性 好、免 疫原性 强 的弱 毒 株 。弱毒 株 可 以通过 不 同途 径 和 方 法获 得 [章 以浩 等 1966，Kisary 1978]。几 年来 ，作者 对草鱼 出血病病毒 株进行 了减毒研究 。现将 结果 综合报道如下 。 1 材料和方法 1．1 病 毒 具 有强毒力 的 GCHV一892野毒株 (下称892株 )来源于珠江 三角洲 池塘 出现 典型病症 的草 鱼肝 、脾 、肾组 织 ，取样 后作如 下处理 ：剪 碎 、匀浆 后用不含 小牛血 清 的199培养液 稀 释10 倍 ， 置冰 箱4"C预冷 。JTJ100O0rpm 离 L,20分钟 ，上清液 即为 除菌组织病 毒液 ，经无 菌检验后 即可用 于本试验 。 1．2 细胞 由本所建立 的草 鱼吻端 成纤 维细胞 系 PSF是对草 鱼出血病 病毒 敏感 的细胞 系(李焕林 等 1988)。将细胞培养于含 10 小牛 血清 的199培养液 (日本 产培 养基 )中 ，待细胞长成致密单层后 1998— 06— 01收 到 (1)李焕 林 ，许 嘏英 ，邓 国成 等．1988．草鱼 吻端成耋千维 细胞 系 PSF的建 立及其 生物学 特性 ．中国 水产科 学研究 院学报 (1)，1～ 8． 维普资讯 http://www.cqvip.com

212 上海水产大学学报 7卷 供减毒研究用 1.3药物 在野外采集的细叶核树叶,用自来水洗净,室内凉干。称10克老叶并剪成小片,用双蒸水 100mL煮沸约2分钟,纱布过滤。补足失去的水分,得10%桉叶药液(下称核液)。再经10磅高压 蒸气消毒30分钟,置4℃冰箱备用,此即为试验原液用时加培养液稀释至所需浓度 1.4892株减毒过程观察 取长成致密单层的PSF细胞,用0,25%胰蛋白酶和002%乙二胺四乙酸二钠混合消化液 消化约1分钟,倒掉消化液,加入培养液,用吸管吹打使细胞分散,然后加入除菌组织病毒液,使 病毒最终浓度为1500分装入细胞瓶(细胞浓度1.5×10个/mL)置28℃培养2~3天细胞长 成致密单层镜检PSF细胞无产生病变。根据出血病病毒感染草鱼后,草鱼的发病时间为1周 左右,因而8~10天收获。收获后的细胞病毒液置-70℃保存,作为试验用的细胞毒种 (1)在PSF细胞培养液中加入桉液,使桉浓度分别为1:100、1x200、1:500、1:1000、 1:5000,110000每一试验(浓度)组和对照组各分装4瓶细胞,置28℃培养连续观察96小时, 每隔24小时镜检并记录细胞生长情况 (2在细胞传代和接入病毒的同时,在各组培养液中加入桉液(病毒的最终浓度为1:20) 使它们含桉的浓度分别为111000、1:5000、1:1000,0置28℃培养8~10天收获,并置-30℃冰 结融化后的细胞病毒液用0.65%生理盐水稀释10倍,以每尾0.2mL接种草鱼种。观察15天, 检查892株在上述三种桉液浓度作用下的毒力变化 (3)通过对草鱼感染试验证实892株在上述三种桉液浓度作用下都能正常增殖后,按上述 接种病毒的方法在PSF细胞中连续继代驯化每隔5~7代将收获的细胞病毒液用0.65%生理 盐水稀释102倍,以每尾0.2mL剂量接种草鱼。检查892株在不同浓度核液作用下的减毒效果 (4)将桉液稀释度为11000的组在PSF细胞中继续传代驯化,并将每一代的细胞病毒液 按上述方法进行检查,观察桉液对892株的减毒效果。 (5)经核液作用减毒的892株传至2?代后,不再加入核液,继续传至37代。观察致弱病毒的 安全性和免疫原性 (6观察用89225~2?代制备的冻干弱毒疫苗对草鱼的安全性和免疫原性 1.5试验鱼 试验用鱼为全长9~12cm的当年草鱼种,在水泥池暂养期间用药物杀灭体表及鳃的寄生 虫和细菌等病原体,确保鱼体健康 各试验组和对照组的鱼数均为每组10尾。 2结果 21桉液对PSF细胞生长的影响 结果见表1由表1可知前三种核液浓度的毒性较大,影响细胞正常生长。而后三种浓度对

上 海 水 产 大 学 学 报 7卷 供减毒研究用 。 1．3 药物 在野 外 采集 的细叶桉 树 叶 ，用 自来水 洗净 ，室 内凉干 。称10克老 叶并 剪成 小片 ，用双 蒸水 lOOmL煮沸约2分钟 ，纱布过滤 。补足失 去的水分 ，得1O 桉 叶药液 (下称桉 液)。再经 1O磅高压 蒸气 消毒3吩 钟 ，置 4℃冰箱 备用 ，此 即为试验原液 。用时加培养液 稀释 至所需浓度 。 1．4 892株减毒过程观察 取长成致 密单 层的 PSF细胞 ，用0．25 胰 蛋 白酶和 0．02 乙二胺 四乙酸 二钠混合 消化液 消化约 1分钟 ，倒 掉消化 液 ，加入 培养 液 ，用 吸管 吹打 使细胞分 散 ，然后 加入 f棠菌组织病 毒液 ，使 病毒 最终 浓度 为1；500。分装入 细胞 瓶 (细胞浓度1．5×10个／rim )。128"C培养 。2～3天 细胞长 成致 密单 层 。镜检 PSF细 胞无产生病变 。根据 出血病病毒感 染草 鱼后 ，草鱼的发病 时 间为1周 左右 ，因而8～10天收获 。收获后 的细胞病毒液置 一7O℃保存 ，作为试验用 的细胞毒种 。 (1)在 PSF细 胞培 养 液 中加 入 桉 液 ，使 桉 浓 度 分 别 为 1 100、1t200、1：500、1：1000、 15000、1；10000。每一试验 (浓度 )组和 对照组 各分 装4瓶 细胞 ，置 28I]培养 。连 续观察 96小时 ， 每隔24小时镜检并记录细胞生 长情况 。 (2)在细胞传代和接 入病毒 的同时 ，在各组培养液 中加 入桉液 (病 毒的最终浓 度为 120)， 使 它 们含 桉 的浓 度分 别为 1；1000、15000、1 10000，置 28I]培养 8～ 10天收获 一并置 一30℃冰 结 。融 化后 的细胞病毒 液用065 生理盐 水稀释 1O。倍 ，以每尾0．2mL接种草 鱼种 。观察 15天 ， 检查892株在 上述 三种桉液浓度作用下 的毒力变 化 。 (3)通过对草 鱼感 染试验证 实892株在上述三种桉 液浓度 作用下都 能正常增 殖后 ，按上述 接种病毒的方法在 PSF细胞中连 续继代 驯化 。每隔 5～7代将 收获 的细胞病 毒 液用0．65 生理 盐水稀释1O。倍 ，以每 尾0．2mL剂 量接 种草鱼 检查 892株 在不同浓度桉 液作用下的减毒效果 (4)将桉 液稀释度 为1 1000的组在 PSF细 胞中继续传代 驯 化 ，并将 每一代 的细胞病 毒液 按 上述 方法进行检查 ，观察桉液对892株的减毒效果 。 (5)经桉液作用减 毒的892株传 至27代 后 ，不再加入桉 液 ，继 续传 至37代 。观察 致弱病毒 的 安全性和 免疫原性 。 (6)观察 甩892株25~27代制备 的冻干弱毒疫苗对草 鱼的安全性 和免疫原性 1．5 试验鱼 试验用鱼为 全长9~12cm 的 当年 草鱼种 ，在水 泥池暂养 期间 用药物杀灭 体 表及 鳃的 寄生 虫和 细菌 等病原体 ，确保鱼体健康 。 各试验 组和对照组 的鱼数均为 每组 10尾 。 2 结 果 2．1 桉液对 PSF细胞生长的影响 结果 见表1。由表 1可知前三 种桉 液浓度 的毒性较 大 ，影 响细胞 正常生长 。而 后三种浓度 对 维普资讯 http://www.cqvip.com

许淑英等,草鱼出血病病毒减毒的研究 213 细胞无不良影响细胞生长正常。 表1PSF细胞系在含不同浓度桉的培养液中的生长情况 Tab. 1 Growth of cell line (psF) in culture solution wlth different concentration of liquld being from An leaves 培养时间(小时 棱液浓度 100多数细胞聚成小团,呈垦状生长多数绷胞呈星状生长尚有部分细胞呈星状生长不能长成单层细胞 1.200多数细胞聚成小团呈垦状生长细胞生长较均匀 长成单层细胞〔90%长满)部分细胞高壁或贴壁不牢 1500多数细胞聚成小团,呈星状生长细胞生长较均匀 长成单层细胞〔9%长滴)少部分细胞离壁 11000生长正常(细胞分散,生长均匀)生长正常 长成单层细胞〔90%长满)长成致密单层细胞 15000生长正常(细胞分散,生长均匀)生长正常 长成单层细胞〔90%长满)长成致密单层细 110000生长正常(细胞分散,生长均匀》生长正常 长成单层细胞〔90%长满〕长成致密单层细胞 对照生长正常(细胞分散,生长均匀》生长正常 长成单层细胞〔90%长满)长成致密单层细胞 2.2三种不同浓度桉对892株的减毒效果 将PSF细胞分别在含核为11000、1:5000 和1:10000三种浓度的培养液中传代并接入病 毒,置28℃培养8~10天。将收获后的三种浓度 细胞原(1)代病毒液稀释102倍,分别接种草鱼 结果三组草鱼的发病死亡率均高达90% 100%表明原代病毒均具强的毒力将上述的 892株在细胞中传至19代,每隔5~7代取病毒稀 释液分别接种草鱼,结果见图1。从图1可以看 出,三种浓度的桉液对892株毒力减弱迅速。三确代量 组病毒传至第6代引起草鱼发病死亡率降至 20%~70%,传至第13代引起草鱼发病死亡率图1三种楼液浓度作用下收获的细胞病毒液 对草鱼致病减弱的情况 病毒在该三种核浓度中传代都几乎同时达到减Fig1 Effect of virus solution of cell under3 毒目的。 different concentrations of An liquid 2.3桉液对19~29代病毒的减毒效果 on ability of coningdisease of grass carp 注:病毒稀释度102,剂量0.2mL/尾 在11000浓度核液作用下,病毒在PSF细 胞中从19代连续传至29代,取各代细胞病毒液分别稀释10和102倍注射草鱼。观察15天草鱼均 不发病。再以草鱼出血病强毒(毒价为101LDs/0.2mL)攻毒。观察15天,其免疫保护率均达 100%(见表2)结果表明病毒在这一浓度的核液作用下减毒明显减毒效果稳定,安全性好, 且免疫保护率高。 2.4不再加桉液的第28~37代病毒液的安全性和免疫原性 通过核液减毒的892株传至27代,培养液中不再加入核液。对28~37代的细胞病毒液分别 稀释10~10倍,注射草鱼后的成活率和免疫保护率均达100%(见表3)表明病毒株经核液作

3期 许 淑英 等 t草 鱼出 血病病 毒 减毒 的研 究 细胞无不 良影响 ，细胞 生长 正常 表1 PSF细胞幕在含不同浓鏖按的培井液 中的生长情况 Tab 1 Growth ofcellHne (PSF)in culturesolution with differentoDnoen订 It10n of liquid being from An Ie¨ 睁 萎l和毒细结8释O9胞21，果液株置％。原1分三2。在0表8(别组1细℃)明接培代草胞三原种养病中鱼代草毒传8浓的病～鱼至液度发1毒．稀o的病结9均天代释培果死具。将1．养每0见亡强液收倍隔图的率获中，51分毒均～后。传从别力7高的代接达并三将取1种接上可9病0草述入浓毒以鱼病度看～的稀。《．o『}l【II_-_．-_-●-_-_●一■_-工． —_-IL 2．4 不再 加桉 液的第28~37代病毒液的安全性和免疫原性 通过桉 液减毒 的892株传 至27代 ，培养 液 中不再 加入桉 液 。对28～37代 的细胞病毒 液分别 稀释 1ol～lO倍 ，注射 草鱼后的 成活率和免疫保护率 均达 10O (见表3)。表 明病毒株 经桉液作 维普资讯 http://www.cqvip.com

214 上海水产大学学报 用在细胞中传至一定代数后,病毒毒力已减弱并且相当稳定其后不需再加桉液作用传代的 致弱病毒对草鱼的安全性和免疫原性仍然保持稳定不变。 衰2GCHv892弱毒化后的19~29代病液对草鱼的安全性和兔疫保护率 Tab 2 Innocuity and percent relative protection of virus solution in 19--29 gen. of GCHV-892 attenuated for grass carp 按液浓度注射剂量 免疫 (mL/尾)毒株代数稀释倍数试验组死亡率对照组死亡率免疫组死亡率对照组死亡率免疫保护率 (%) 0p0 24 1:1000 000000000000 0 00000000 0 00000 注兔疫保护率(%)-(-舞魔组死亡 100 3不再经按液作用的892株28~37代的安全性和兔疫原性 Tab 3 Innoculty and Immunogenicity of 28-37 generations of strain-892 out of affect of An lould 攻 卷株代数稀释倍数试验组死亡率对照组死亡率 免疫组死亡率对照组死亡率免疫保护率 000 00000000 80000000m 100 000000 0 100 Q o000 0000o

上 海 水 产 大 学 学 报 7卷 用在细胞 中传至一定代 数后 ，病 毒毒力 已减弱 ，并且 相当稳 定。其后 不需再 加桉液 作用传代 的 致弱病毒对草鱼 的安全性和免 疫原性仍 然保 持稳定不变 。 裹2 GCHV一892弱毒化后的19～2玳 病毒液对草鱼的安全性和免疫保护牢 Tab·2 Innocuity and percentrelativeprotection ofvirussolution 裹3 不再经 按液 作 用 的892株 28～37代 的安全 性 和免 疫原 性 维普资讯 http://www.cqvip.com

许淑英等:草鱼出血病病毒减毒的研究 215 2.5冻干弱毒疫苗对草鱼的安全性和免疫原性 用892株25~27代细胞病毒液分别制备4批冻干弱毒疫苗每批疫苗随机抽取2瓶(每瓶含 病毒和保护剂5mL)用生理盐水稀释101~103倍草鱼经分别免疫后成活率都达100%再以 草鱼出血病强毒攻毒观察15天,免疫鱼几乎全部成活,而对照鱼死亡率高达80%~100%(表 4)。表明经桉液减毒后的弱毒株制备的冻干弱毒疫苗仍能保持原有的安全性和免疫原性作者 将这一弱毒株定名为 GCHAV-892。 衰4各批冻干弱害疫苗的安全性和免疫原性 Tab 4 Innocuity and immunogenlelty of 4 batches of attenuated live vaccine 疫苗批号稀释倍数试验组死亡率对照组死亡率免疫组死亡率对照组死亡率免疫保护率 0000000 00000000000 100 00000 01 02 01 0000 3讨论 1)本研究采用的细叶桉树叶是一种具有一定毒性的中草药。其叶供药用,有消炎杀菌的 功效桉叶的挥发油中主要含有7种有毒成分,如18一桉叶素、蒎烯、芸香甙等[朱正峰1991]。 般来说具有改变和破坏病毒核酸和蛋白质的理化因子,包括热辐射、pH和化学剂等对病 毒具有灭活作用但是这些理化因子较低程度或稍低剂量的处理往往导致病毒变异,并不引 起病毒灭活故在一定意义上讲,灭活剂和话变剂只是“量”或“程度”上的差别较少剂量或较 低浓度的灭活剂常常呈现诱变作用[股震和刘景华1985]病毒的变异类型有多种,其中一 种是“毒力”变异:病毒变异后,或增强毒力,或减弱毒力。后者可用于制成弱毒活疫苗[余溃 1983]本文使用某一浓度范围的核液对草鱼出血病病毒株进行减毒的结果,强毒株的毒力迅 速减弱,且致弱病毒的安全性和免疫原性又能保持稳定不变。由此可见草鱼出血病病毒对某 浓度范围的桉液是适应的,并且能够增殖和产生变异桉液起了诱变剂的作用。至于核液的减 毒作用机理,尚有待进一步深入研究。 (2)本研究采用桉液某一定浓度作为GCHV892毒株的减毒剂结果减毒迅速、明显,且稳 定。传至第6代毒力已下降,第13代毒力明显下降,传至19代时已达到减毒目的用该病毒液注 射草鱼种后均不发病成活率100%过去没有加入核液而用同样方法传代的GCHv-841株需

3期 许 淑英 等 ：草 鱼出血 病病 毒减 毒 的研 究 2．5 冻干弱毒疫苗对草鱼的安全性和免疫原性 用 892株25～27代细胞病毒液分 别制备 4批冻 干弱毒疫苗 。每批疫苗 随机抽取 2瓶 (每 瓶含 病 毒和保护 剂5mL)。用 生理盐 水稀释 10-10倍 。草 鱼经分别 免 疫后成 活率都达 100 再以 草 鱼出血病强毒攻 毒 观察 15天 ，免疫鱼 几乎全部成 活 ，而对照 鱼死亡率高 达8O ～l00 (表 4)表 明经桉液减毒后 的弱毒株制备 的冻干弱毒疫苗仍能保 持原有的安全性和免疫原性 。作者 将 这一弱毒株定名为 GCHAV一892。 裹4 各批蒜千弱毒疫苗的安全性和免疫膘性 Tab．4 InnocMty and im m unogenlcltyof4 batchesofattenuated live vaccine 9402 3 讨论 (1)本研究采用 的细 叶桉树 叶是一种具有一定毒性 的中草药 其 叶供 药用 ，有消炎杀 菌的 功效 。桉 叶的挥发 油中主要 含有7种有毒成分 ，如1，8一桉 叶素、蒎烯 、芸香 甙等 [朱正 峰 1991]。 一 般来说 ，具 有改变和破 坏病 毒核 酸和 蛋 白质 的理化 因子 ，包 括热 、辐射 、pH 和化学 剂等对病 毒具有灭活作 用。但是这 些理 化 因子较 低程度或稍低剂 量 的处理 ，往往导致病 毒变异 ，并 不引 起 病毒灭 活。故在一 定意 义上讲 ，灭活剂和诱 变剂 只是“量 或 “程度”上的差别 。较少 剂量或较 低 浓度 的灭活剂 ，常常 呈现诱变 作用 [殷 震和刘景 华 1985]。病毒 的变 异类型 有多种 ，其 中一 种 是“毒力 变异 ：病毒变异后 ，或增强毒力 ，或减弱毒力 。后者 可用于制 成弱毒 活疫 苗 [余 湖 l983]。本文使用某 一浓度 范 围的桉液 对草鱼 出血病病 毒株进行 减毒 的结果 ，强毒株 的毒 力迅 速减弱 ，且致弱病 毒的安全性和免疫原性 又能保持 稳定不变 。由此 可见 草鱼 出血 病病 毒对某 一 浓度范 围的桉液是适应 的 ，并且能够增 殖和产 生变异 桉液 起 了诱 变剂 的作用 。至于桉液 的减 毒作用机理 ，尚有待 进一步深入研究 。 (2)本研 究采用桉液 某一定浓度作为 GCHV一892毒株 的减毒 剂 ，结果减毒迅速 、明显 ，且稳 定 。传 至第6代毒 力 已下 降，第13代毒力 明显 下降 ，传至19代 时 已达 到减毒 目的 。用 该病毒液注 射 草鱼种后均不发病 ，成活率100％。过去没有加入桉液而用 同样方法 传代 的 GCHV一841株 ．需 ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 帅 ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ⅢⅢ m帅帅帅舯舯舯 0 0 盱 O O O O O O O 盱 维普资讯 http://www.cqvip.com