《草鱼出血病》草鱼出血病细胞疫苗制备技术研究

第12卷第1期 鱼类病害研究 1990年 草鱼出血病细胞疫苗制备技术研究 杨广督张念慈叶雪平罗毅志 (渐江省战水水产研究所) 病毒性草鱼出血病是一种严重危害草鱼的疾病。免疫预防是防治该病的有效方法。近几 年来,应用组织疫苗预防出血病已在生产上取得了一定的效果。但是制作组织疫苗的材料来 源于病鱼组织,因此疫苗产量有限,且效价不稳定。所以研究高效、稳定且能工厂化生产的 细胞疫苗是草鱼出血病防治研究的重要课题之一。 我所建立草鱼出血病敏感细胞株ZC·-7901后,应用该细胞株繁殖病毒并进行细胞疫苗 制备的研究,于1985年全国鱼研究会上报道了研究结果。在此基础上,我们对细胞疫苗的 制备方法和免疫效果作了进一步深入研究,并进行生产性防治试验。现将结果报道如下。 、细脑疫苗制备的材料和方法 )细胞和细胞的培养 根据细胞对病毒敏惑性、病毒的繁殖量以及繁殖病毒抗原性的筛选,选用本所建立的ZC 7901细胞株和草鱼胚胎传代细胞,作为制备疫苗的细胞。ZC—7901细胞株为150-20代 细胞。培养液为含10%小牛血清的199液,每毫升并含1000单位霉素和100微克链霉素。以 0,02%EDTA为消化液,1:5传代,3--1天长成致密单层。 (二)病毒和病毒的培养 1.病毒株的筛选:收集典型出血病草鱼的肝、脾、肾等组织,以无血清的199维持液 制成病毒悬液,02μ滤膜过滤除菌接入上述细胞,并按下述病毒培养法进行连续传代培养 以细胞病变法和鱼体惑染法测定毒力并将细胞的病毒培养物制成疫苗,免疫草鱼后测定保护 率,同时从细胞的病毒培养物中提取病毒,电镜观察有较多的病毒粒子,从中筛选毒力较 强,免疫原性较高的毒株,目前使用的毒株为zV-8802。 2.病毒的培养法:采用适应培养法,将病毒株ZV-802,以无血清199维持液稀释 后,以吸附法接入细胞中,待细胞刚出现病变时,将病毒细胞用汉克斯液洗涤后,0.02% EDTA液消化细胞,再用10%小牛血清199液制成细胞悬液,然后加入适量正常细胞后静 止培养,培养温度25℃,并按此方法连续传代,传代至第十代开始,用旋转管法进行扩大培 三)病毒的扩大繁殖 采用旋转管适应培养法,将上述病毒细胞用10%小牛血清19液稀释成10~12×105细 胞/毫升,加入等量正常细胞,接入旋转管(管的底面积6cm,管高6cm),加培养液18毫 12

f12ef1期 鱼 类 病 害 研 究 1990年 草鱼 出血病细 胞疫苗 制备技术研 究 杨广智 张念慈 叶雪平 罗毅志 (浙江 省 淡水水 产研 究所 ) 病毒性草鱼 出血病 是一种严重危 害草 鱼的疾病 。免疫预 防是防治该病的有 效方 法 近几 年来，应用组 织疫苗预 防出m病 已在 生产上取得了一定的效果。但是制作组织 疫苗 的材 料来 源于病 鱼组织 因此疫苗 产量有限， 且效价不稳定。所以研究 高教、稳定且能 工厂 化生 产的 细胞 疫苗 是草 鱼出血病 防治研究的重 要课 题之一。 我所建立草鱼 出血病敏 感细 胞株 zc一7901后 ，应 用该 细胞株繁殖病毒并 进行 细胞疫苗 制备的研 究， 于1985年全国鱼病研究会上报道了研究结果。在 此基础上，我们 对细 胞疫苗的 制备 方法 和免疫效果作 了进 一步深入研究，并 进行生产性 防治试验。现将结果 报道 如下。 一 ， 细 臆 疫 苗 捌 鲁 的材 料 和 方 法 (一 )细 胞和细胞 的培 养 根据细胞对病 毒敏感性、病毒的繁殖 量以及繁殖病毒抗原性的筛选，选用率所建立的ZC 一 一 79O1细胞 株和草鱼胚胎传代细胞，作为 制备疫苗的细胞。zc一790t细胞抹为150-2oo4~ 细胞。培养液 为含 10 小牛血清的]99渡，每 毫升并含1000单位青霉素和100微克链 霉素。 以 0．02％EDTA为 消 化辛葭， 1t5传 代 ， 3— 4天 长 成 致 密单 层 。 (二 )病 毒 和 病 毒 的 堵 养 1．病毒株的筛选 t收 集典 型出血病 草鱼的肝 、脾 、肾等组 织， 以无血清 的 199维 持液 翩成寐 毒悬 液，0．2P-滤膜过滤除菌接入上述细胞，并按 下述病毒堵养 法进 行连 续传代培养， 以细 胞病 变法和鱼体感染法测定毒力，并 将细胞的病 毒堵养物制成疫茁，免疫草 鱼后 测定 保护 宰， 同时 从细 胞的病毒 培养物 中提取病毒， 电镜观察有较多的 病 毒 粒 子， 从 中筛 选毒力较 强，免疫 原性较 商的毒株， 目前使用的毒株 为zV一8802。 2．病 毒 的培 养 法 。 采 用 适 应 培 养 法 ， 将 病 毒 株 ZV一 8802， 以 无 m 清 19g维 持 液 稀 释 后， 以吸甜 法接入细胞 中，符细胞刚 出现病变时，将病毒细 胞用汉克 斯液 洗涤后，0．02 EDTA液 消化 细 胞 ， 再 用 1O 小 牛 血 清 199液 制成 细 胞 悬 液 ， 然 后 加 入 适 量正 常细 胞 后 ． 静 止堵算，培养温度 25℃，并 按此方法连 续传代，传代 至第十代开始，用旋转管法进行扩大培 葬。 【三 )病毒的扩犬繁殖 采用旋转管适应培养 法， 将上述病 毒细胞用 l0 小牛血清 199液稀释 戚 lO～L2×10 细 胞，毫升，加入 等量正常细胞· 接入旋转管 (管的 底面 祝6cm，管高 6．5cm)，加培养液l8毫 12 维普资讯 http://www.cqvip.com

升。在AD—1型单细胞旋转培养机上旋转培养,旋转速度为12转/小时。逐日观察细胞病 变,一般在第4-5天,再以上述方法扩大传代。根据病毒适应培养法的病毒增殖动态,收 集第15-25代的病莓培养物,低温保存,用于制备细胞疫苗。 (四)病毒春力的测定 以TCLD,法和鱼体感染法测定繁殖病毒的莓力,制备疫苗所用病毒的毒力指标为 TCLD法在8以上,鱼体感染法指标为,将病毒稀释10后鱼体死亡率90%以上。并结合 ELSA法和SPA细胞粘附法测定,作为辅助指标。 (五)病毒的灭活和佐剂、增效剂的加入 根据灭活条件中福尔马林浓度、灭活温度和时间三因子的对比试验结果,以病毒的培养 物中加入0,1%福尔马林,37℃灭活48小时,其疫苗的免疫保护率最高加入佐剂AI(OH)和 临用前加入L一精氨酸有明显的增效作用,能使疫苗的免疫保护率提高12-17% 六)细胞疫苗的安全性试验 草鱼注射疫苗后,在网箱或水泥池中饲养,水温25-28℃,观察半个月以上。数批疫苗 经试验均未发现啶苗带毒现象。 、纽胞疫苗的免疫保护率测定 草鱼注射疫苗后,在网箱或水泥池中饲养半个月以上,用102病毒悬液分别注射感染免 疫鱼和对照鱼,视鱼体大小每尾注射03-0,5毫升,在水温25-28℃的水泥池中,饲养观察 半个月,根据病死比例,以下公式计算免疫保护率。 免疫保护率—对照组病死率二兔疫组病死率×100% 对照组 病死率 (一)细胞疫苗的免疫保护率 八五年共测定三次平均保护率为766%(70-90‰);八六年共测定四次,平均保护 率为825%(80-90%),八七年共测定四次,平均保护率为85%(80-90%);八八年共 测定二次,平均保护率为87.5%(80-95%)。上述四年试验表明,细胞疫苗具有较高的免 疫保护率,八六年后均在80%以上。 在八七年对同塘饲养的免疫鱼和未免疫鱼(对照鱼)进行保护率测定。免疫后饲养67天 保护率为82%,97天后为91%189天后为75%。其结果表明,草鱼注射细胞疫苗后其免疫 力能保护较长时间,至于免疫力能维持多久?有待进一步试验。 (二)细胞疫苗和组织疫苗保护率的对比测定 选择不同的出血病草鱼制备组织疫苗(加0。1%福尔马林,32℃,72小时灭活)与同年 制备的四批细胞疫苗,分别注射免疫草鱼,进行免疫保护率的测定。组织疫苗的保护率分别 为2090,6%,809,87%,平均保护率为617%细胞疫苗的保护率分别为75%,83% 85%,90%,平均保护率为83,2%。试验结果表明,细胞疫苗不仅具有较高的保扩率,且效 价稳定。 三、细腳疫苗预防草鱼出血病的鱼池试验 (一)注射免疫试验

升 。在 A D一．1型 单鳃胞旋转培养 机 上旋转培养，旋 转速度为 l2转／小时· 逐 日观察细 胞病 变， 一般在第 4— 5天，再以上述方法扩犬传代。根据病毒适应培 养法的病 毒增殖动态，收 集第 l5— 25代 的病 毒培 养 物 ， 低 温 保 存 ， 用 于制 备 细 胞 疫 苗 。 (四 )病 毒 毒 力 的 涮 定 以 TCLD 。法和龟体感 染法测定繁 殖病毒的 毒力 ， 制备疫 苗 所用病 毒的毒力 指标 为 TCLD．。法在 ．8以上， 伍体感染法指标 为， 将病 毒稀释10-a后鱼 体死亡率90％以上。并结 合 ELISA法和SPA细胞粘 附法测定， 作为辅助指标。 (五 )病 毒的灭 活和佐 剂 增效剂的加入 根 据死活条件 中福 尔马林浓度．灭活温度和时间三 因子的对 比试 验结果 ， 病 毒的培养 物 中IjJ玎A．0．1 福尔 马林，37℃灭活蚰小州，其疫苗 的免疫 保护 率最 高。加入佐剂AI(OHh和 临用前 加 入L一精氨酸 有明显的增效作用，能使疫苗 的免疫保 护率提高12一 ]7％。 (六 )细 胞疫苗 的安垒性 试验 草鱼注射疫苗后， 在 网箱 或水泥池 中饲养，水温25—28℃，观察半 个月 以上。熬批疫苗 经试 验 均 未 发 现疫 苗 带 毒 现 象 。 二 、 细 胞 疫 苗 的 免 疫 保 护 率 测 定 草鱼注 射疫苗 后， 在 网箱或水泥池 中饲养半个月 以上，用lO 病毒悬液分别 注射感染免 疫鱼和对照鱼，视 鱼休大小每尾注 射0．3—0．5毫升 ，在 水温25— 28℃的水泥 池中，饲养 观察 半个月，根 据病死 比例， 以下公式计算 免疫 保护率 。 触保护牢一勰 罴嵩 癌醚 Ⅷ。％ (一 )细胞疫苗的免疫 保护率 八 五年共 测定 三次，平均保护率为76．6 (70—90 )’八 六年 共 测定 四次，平均 保护 率 为82．5％ (80— 90％ )，八 七年共测定四次，平均保护率为85％ (80— 90 )，八八 年共 测定二 次，平均 保护率 为87．5％ (8O一95 )。 上述 四年试验 表明，细 胞疫苗具 有较 高的 免 疫 保 护率 ， 八 六 年后 均 在 8O 以上 。 在八七 年对 同塘饲 养的免疫龟和未免疫 龟 (对照鱼 )进 行保护率谫I定。免疫后饲养 67天 保护率为82 ，97天后 为9l ，i89天后为7j 。其结果表明， 草鱼注射细 胞疫 苗后其免疫 力 能保护较 艮时间， 至 于免疫力 能维持多久 ?有 待进 一步试验。 (二 )细胞疫苗 和组织 疫苗保护率的对 比测定 选择不 同的 出血病 草鱼制备 组 织疫 苗 (加O．I％福 尔马林， 32℃，72小时灭 活 )与同年 翩备的玛批细胞疫苗， 分别注射 免疫 草鱼， 进行免疫保护率的谀l定。组织 疫苗的保护率分 剐 为20 ，6O ，80％，87 ，平均 保护率为61一．7％’ 细胞 疫苗的保护率 分别为75 ，83‰ 8 ， 90 ，平 均保护率 为83．2 。试 验结果 表明， 纽胞 疫苗 不仅具有较高的保护率 ，且 效 价 稳 定 。 三，细膪 疫苗预防草鱼 出血 病的氢池试验 (一 )注射免疫试验 l3 维普资讯 http://www.cqvip.com

在冬季或春初鱼种放养时进行免疫注射,视体大小每尾注射0,3~0,5毫升,年底起捕 统计草鱼成活率。同时设对照塘(组).对哪种注射199培养液,试验结果列于表1和表 衰1 养鱼专业户鱼塘试验结果 验鱼数出培鱼数成活率同组成 类别 试骑鱼塘 注射锕 尾) 尾 (%)活率(% 永丰一趴骆阿海塘细胞疫苗454 76.3 免疫塘 宋荣塘细胞瘦苗 560 148 骆阿海塘199 对照塘 57 宋锦荣塘199 249 60 裹2 本所试验场试验结果 试验鱼数|出塘鱼数成活率 成活率 试验塘 注射物 显著差异枪验 尾) (尾 (% 苗 90 试 菱湖1“ P<0.05 199 疫苗 菱湖2 P>0,05 疫苗 菱湖3 P<0,05 疫苗 97 80.8 菱湖10 P<0 199 120 50 疫苗 夹山漾12 P<0,05 疫苗 3了 夹山涂17 P 一一一 夹山漾20 疫苗 P<0,05 疫苗 夹山漾21 P<0,03 50 29 58 表1·为同一村邻近鱼池进行免疫鱼塘和对照鱼塘草鱼成活率对比试验结果,结果表明 兔疫鱼塘草鱼成活率高于对照负塘210

～ 。 茬r鬼季或春初鱼种放幕时进存免疫注射，视包绎火小每尾注射0．3NO．5毫升，年底起捕 统计 草 煎成活率。同时设对照 塘 (组 )，对照鱼种沣射199培 养液，试验结 果列于表 1和表 2 。 裹 1 养 鱼 专 业 户 鱼 塘 试 验 结 果 J试验 鱼数 Ⅱj塘 龟数 成 活率 同组成 类 别 试验 龟塘 注 射物 1 <尾) (尾) 』 ( ) {活率( ) 永丰一 队酪阿海塘 l{细胞疫苗 454 346 76． 3 踅疫塘 ， f ●u●u 。 宋 锦 荣塘 细 胞疫苗 560 448 8O ～ I 对照塘 ” 骆阿海塘 I199 I 850 d67 5 ● V ” 宋锦荣塘 l1g9 l 400 24g 60 试验塘 l 注射物 · ‘ 一 叶 I 190 本 所 试 验 场 试 验 结 果 I 试 验鱼数 j出塘 色数 (尾 ) t (尾 ) 菱瑚’ }『疫g苗9一十I一99．00 Ti7650 一{成摹 { ；c 哪 ．- - ＼ u．ua 199 · 5 33 64 痘 苗 I 120 97 I 80． 8 、 ～ 蔓 溯10’ 尸< 0．O5 19g 120 50 41．7 疫苗一 50 39 78 吏 山豢12’ P<0． 05 ， 。199 50 2I 42 疫苗 _ 5O 37 76 _兜山漾17’ P> O． 06 1g9 50 2O 60 L 一 … ， 一 — — ，． 疫 苗 ． 5． 0 ． 41 牡 P< 0．05 ÷t99 ，暑 go}： 3O 60 症苗 ’ -．5 4"0 J 80 一 夹 IJ1漾 21’ P< 0． 05 由 9 50 29 58 对 照 组 成 活 蛊 一 L _ 表 1．为同一村邻近鱼池进行免疫鱼塘和蜡照氆塘草鱼成活率对比试验缔果，结果表明 免疫氲塘草角成活率高于对照鱼塘21，O／o 14 虾 一曲 渤L昌 维普资讯 http://www.cqvip.com

長2.为充卡所试验场进行免疫色和未兔疫鱼(讨照)同瑭饲养(兮别剪鳍条标记)的 试验结果。结果表明,免疫组的草鱼成活率均高于对照组,同组平均成活率免疫组比对照组 高25.3%,经显蓍性差异检验除2号和17号瑭外(P>0.05),其余各组成活率对比均有明 显差异(P005)。 (二)浸泡免疫试验 在每年的6月份对夏花鱼苗(08-1寸)进行浸泡免疫试验(具体方法另文报道)。 免疫组以细胞疫茁浸泡,对照组以199培养液浸泡,试验在6-12月份进行,试验结果列于 表3和表4。 表3和表4结果表明,免疫组成活率明显高于对照组,其中86年免疫组比对照组高329%, 87年免疫组比对照组高20,5%。 表3 细胞疫苗浸泡萆鱼夏花免疫试验结果(87)年 试验鱼数 出塘负敬 类别 成活率 试验塥 下均 (尾 (6) 宋泉林塘 738 试验搪 骆阿海塘 80,5 对照 宋红昌塘 2000 1245 62.2 表4 细胞疫苗浸泡夏花鱼种试验结果(86)年 试验鱼塘 类別 出塘氫数成活丰 试验堋 平均 浸泡疫 竖阿海斯 苗的试 宋锦荣塘 成活率 验塘 宋子财坤 68 499 宋子根塘 浸泡199 宋泉林塘 3600 1128 3 对照坤『均 的对照塘子民塘 41。6 成活率 宋红昌塘 587 9o 四、细胞疫苗制备的基本流程图 根据几年来的研究,实验室制备细胞疫苗的基本流程已稳定,兹以下图表示,供今后工 厂化生产疫茁的参考 细胞疫苗实验室制备基本流程图 ZC7901细胞株传代培养 病毒株接入 病毒适应培养(静止培养) 培养至第10代起

是 2．为在术所试验场进行 免疫 鱼和 米免疫鱼 (对照 )同精饲 养 (分别 剪鳍 条标 记 )的 试验结果。结果表 明，免疫组 的草 鱼成 活率均高 子对照组， 阿组平均成 活率 免疫 组比对照 组 高25．3 ，经 显著性差 异检 验除 2号 和17号塘外 (P>0。05)，其余各组成活 率 对比均有 明 显 差 异 (P<0．05)。 (二 )浸 泡 免 疫 试 验 在每 年的 6月份 对夏花 鱼茁 (0．8- 1寸 )进行 浸泡 免疫试 验 (具 体方 法另 文报 道 )。 免 疫 组 以细 胞 疫 茁 浸 泡 ， 对 照 组 】99培 养 液 浸泡 ， 试 验在 G一 】2月 份 进 行 ， 试 验 结 果 列 于 表 3和表 4。 表 3和表 4结果 表 明，免疫 组成活牢明显高 于对照组，其 中86年免疫组比对照组高32 ， 87年 免疫 组 比对照组 高20．5 。 表 3 细 胞 疫 苗浸 泡 草 鱼 夏 花 免 疫 试 验 结 果 (87)年 类别 l试验墉 ! 试验龟数 1 (尾 ) 宋 泉 林 塘 800 试 验 塘 … — — 一 ～ ～ — — 骆阿海塘 I 4000 _ - - 一 一 一 对 照 塘 朱 红 昌塘 2000 m塘 血 数 (尾 ) 738 322O 成 活 率 ． ( ) 92．2 80．5 — — I 82．7 1245 ； 62．2 l 62．2 表 4 细胞疫苗 浸泡 夏花鱼种试验结 果 (86)年 娄 刖 浸 泡 疫 苗 的试 验 塘 浸 泡 199 的 对 照 塘 骆阿 海聃 宋锦 荣塘 { 宋子财墉 l 宋 予根塘 米 泉 林 螗 朱 子 民塘 I 朱红昌塘 l 2322 l352 2482 试验枯 平 均 成 活率 74．9 对 照螗 均 成 活率 42．9 四、 细 胞 疫 苗 制 备 的 基 本 渡程 围 根据 几年来的研究，实验室 制备细胞疫苗 的基 本流程 已稳定 ，兹以下图表示， 供今 后 工 厂 化 生产 疫 苗 的 参 考 。 r ． 。 ． 细胞疫苗实 验室制备基本 流程图 ． z ·7901细胞 株传 代 培 养 l 病 毒 株 接 入 } 病 毒适 应培养 (静止 培养 ) 培养至第10代起 I l5 } l i 一 0 8 2 2 6 一2H 2u 9 ∞ ∞ 鲫 一～伽 ∞ 锄 维普资讯 http://www.cqvip.com

旋转管扩大培养病 培养至15代起,在第4-5天收集病毒培养物 5-25代病毒培养物冻融后,合并,一20℃保存。 TCLD5法和鱼体法测定毒力 用PBS液稀释至毒力为TCLD3。8 加0.1%福尔马林,37℃灭活18小时,加A(O)3,临用前加L一精氨酸 安全性试验 效价测定 分装,4℃保存 喂苦荬菜预防草鱼疾病初报 刘天国 河北省东亭县科技水产研究所) 东亭县菜庄乡独豳城刘庄养鱼户刘焕义,自87年起利用塘边土地种植苦荬菜(形状似野 生苦荬菜、但茎高可长到1米),割其茎叶,切碎喂鱼。鲤鱼、草鱼都喜食,节省粮食,鱼 长的快且草鱼不得病。87、88两年,刘在面积为五苗的鱼塘中养鱼,草鱼放养比例约占15% 亩平均产鱼近千斤,且草鱼从不生病。89年将草鱼比例增大到30%,至了月下旬,各种鱼生 长良好,未见草鱼发病。暂作初报,以供信息。其机制有待进一步研究探讨

旋 转管 扩 大 培 养 病 毒 i 培 养至 15代 起， 在 第 4— 5天 收 集 病 毒 培 养 物 ]5—25代病 毒培 养物 陈融后， 合并， 一2O℃保存 。 』 TCLD 。法和茁体法测定毒力 』 甩 PBS液 稀 释 至 毒 力 为TCLD 。3．8 加O．1 福 尔马林，37℃灭 活18小Hl】，加Al(OII)3， I临用前加L一精氨酸 l ’ ” l 、 』 喂 苦 萋 菜 预 防 草 鱼 疾 病 初 报 刘 天 国 - (河北 省东 亭县科 技水 产研 究所 ) 东亭县莱 庄乡独幽城刘庄养鱼户 刘焕 义， 自87年起利用塘边 土地种植苦 萎莱 (形状似野 生昔萎菜 但茎高可瞠到l米 )，割其茎叶，切碎n匣鱼。鲤鱼 ’草鱼帮喜食，节 省 粮食，鱼 长的快且草鱼不得病 87、88两年，刘在面积为孟苗的鱼塘中舞鱼，草鱼放葬比例约占15％， 亩平均产鱼近千斤，且草鱼 从不生病 。89年将草鱼 比例 增大 到30％，歪 ，月下旬，各种鱼生 长良好，未见草鱼发病。暂作扔报，以供信息 其机制有待进一步研究探讨。 维普资讯 http://www.cqvip.com